SLC11A2: 卵巣がんにおける有望なバイオマーカーおよび治療標的

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1132 (2023) この記事を引用

1620 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

卵巣がんは婦人科腫瘍の中で最も死亡率が高く、5年生存率は25％未満です。卵巣がんの疾患負担を軽減するための早期診断と新薬が緊急に必要とされています。この研究の目的は、卵巣がんの治療標的およびマーカーとしての SLC11A2 の有効性を調査することでした。 SLC11A2 の発現データは公共データベースから取得しました。次に、SLC11A2 の生物学的機能が 4 つの卵巣がん細胞株で検証されました。最後に、卵巣がんの臨床組織、血清、血漿エクソソームを収集し、免疫組織化学、Elisa、液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS) を使用して、SLC11A2 の試験有効性を検証しました。その結果、SLC11A2 mRNA発現が高い卵巣がんは5年のPFSとMSTが短いことが示されました。 SLC11A2 をノックダウンすると、卵巣がんの移動が減少し、シスプラチン誘導性のアポトーシスが増加しました。血清 SLC11A2 は、卵巣がんの検出率の向上に役立つ可能性があります。

卵巣がんの死亡率は、女性の生殖悪性腫瘍の中で第 1 位にランクされています 1、2。ポリ ADP リボースポリメラーゼ (PARP) 阻害剤などの分子標的薬の使用は、卵巣がん患者、特に BRCA 変異を持つ患者の生存期間を大幅に延長します 4。生存率は 25% ～ 30% 未満です 5、6。HPV ワクチン 7、子宮頸部細胞診、および HPV 検査の推進により、子宮頸がんは簡単に予防およびスクリーニングできるようになりました。しかし、卵巣がんは隠れて発症し、解剖学的に特殊な位置にあるため8、転移する可能性が高く、死亡率が最も高くなります。早期診断と標的療法を提供する新しい分子を見つけることが、苦境を打開する鍵となります。

イオンチャネルは細胞情報伝達と物質輸送に関与しており、がんにおける悪性挙動と関連しています9。 1997 年に、溶質キャリアファミリー 2 の 11 メンバーである SLC11A2 が、Gunshin らによって鉄輸送体として同定されました 10。 SLC11A2 タンパク質は、トランスフェリン (TF) に依存しない方法で鉄イオンを腸内腔から体内に輸送します。これは、腸が食物からイオン鉄を吸収する唯一の方法です。鉄イオンの発がんには幅広い研究根拠があるが、鉄輸送における重要な分子としてのSLC11A2の悪性腫瘍における役割は依然として不明である。 ying Weijiao らは、TCGA データを分析することによって、 SLC11A2 が子宮内膜がんの予後と関連していることを発見しました 11。 Kaja Michalczykらによる研究。 SLC11A2 の遺伝子多型は子宮内膜がんのリスクと関連していないことを示しました 12。現在、非バイオインフォマティクスに基づいた優位性がん研究は、結腸がんと乳がんについてのみ報告されています13、14。

持続的な鉄刺激が卵巣発がんを促進する 15 こと、SLC11A2 が鉄摂取の主要なタンパク質 16 であり、乳がんおよび結腸がんの進行に決定的な役割を果たすことが示されていることを考慮して、多数の公的に利用可能な発現および生存データベースを使用して包括的な解析を実施しました。一方、我々は、卵巣がん細胞に対する SLC11A2 の効果を in vitro で検証しました。最後に、血清、卵巣癌組織、正常卵巣、正常卵管組織におけるSLC11A2のタンパク質発現、および卵巣癌患者の血清中のタンパク質発現レベルを検出した。

私たちは、3 つの独立したバイオインフォマティクスデータベース (Oncomine、https://www.oncomine.org/resource/login.html、GEPIA2、Gene Expression Profile Interactive Analysis 2、https://gepia2) によって、がん組織とその正常組織間の SLC11A2 発現の違いを調べました。 .cancer-pku.cn; GENT、正常組織および腫瘍組織データベースの遺伝子発現、http://gent2.appex.kr/gent2/)。 GENT データベースでは、汎癌の発現を表示するために 2 つのマイクロアレイプラットフォーム (GPL570 および GPL96) が使用されました。すべてのデータベースはデフォルト設定で実行されました。

卵巣および正常な対応物における SLC11A2 mRNA の発現および遺伝子変異は、CBioPortal データベース (https://www.cbioportal.org) および TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga) を使用して分析されました。 /)。 TCGA および GTEx TPM 形式の RNAseq データは、TOIL プロセスと統合されています17。 TCGA の OV (卵巣漿液性嚢胞腺癌) と GTEx (Genotype-Tissue Expression Project; http://commonfund.nih.gov/GTEx/) に対応する正常組織データを抽出します。 R(ggplot2) を使用してデータを視覚化しました。 UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/ualcan-res-prot.pl) データベースを使用して、卵巣がんに対する組織 SLC11A2 mRNA の検出効率を計算しました。卵巣癌および正常な卵巣組織における SLC11A2 タンパク質の発現は、Human Protein Atlas データベース (https://www.proteinatlas.org/) の免疫組織化学画像で取得されました。切片染色は積分システムを使用してスコア付けされ、染色強度スコアにパーセンテージスコアを乗じて整数値が得られました。染色強度スコアは次のように定義されました: 0、陰性。 1、弱い。 2、中程度。 3、強い。パーセンテージスコアは、すべてのがん細胞に対する陽性細胞の割合を表します。パーセンテージスコアは 1、0 ～ 25% として定義されました。 2、26～50%。 3、51～75%。 4、75 ～ 100%。

卵巣癌における SLC11A2 の発現と予後は、Web ベースのツール Kaplan-Mayer プロッター (http://kmplot.com/analysis/) によって調査されました。 4 つの独立した SLC11A2 mRNA プローブを使用して、各リスクグループにおける SLC11A2 発現を計算しました。生存曲線は、データベース内のデフォルトの最適 P 値に対応するカットオフ値を使用して、すべての患者または臨床病理学的データに対して生成されました。

卵巣癌における SLC11A2 の臨床病理学的重要性は、UALCAN データベース (http://ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/ualcan-res-prot.pl) を通じて包括的に評価されました。臨床サブグループには、FIGO 臨床病期、民族性、TP53 変異、年齢、病理学的分化、およびグレードが含まれます。

TCGA OV (卵巣漿液性嚢胞腺癌) プロジェクト遺伝子からの RNAseq データを使用して、卵巣漿液性嚢胞腺癌と SLC11A2 の共発現を取得しました。データのクリーニング後、SLC11A2 と正の関連がある上位 10 個の遺伝子のバブルチャートをマッピングしました。続いて、上記の卵巣嚢胞腺癌において SLC11A2 と共発現する上位 100 遺伝子を使用して、遺伝子オントロジーおよびシグナル伝達経路分析を実行しました。内容には、生物学的プロセス、キナーゼクラス、タンパク質機能、細胞内位置、薬物、標準経路、およびホールマーク遺伝子セットが含まれます。カテゴリ別のプレゼンテーションの代わりに、Metascape ツール (https://metascape.org/gp/index.html) を使用して、すべてのクラスターの上位 20 を表示しました。

OVCAR8 (卵巣がん細胞株) で SLC11A2 を過剰発現またはノックダウンし、その操作効率を qPCR またはウェスタンブロットによって検証しました。ウェスタンブロットでは、細胞タンパク質が PVDF 膜に転写され、タンパク質マーカーの分子量に応じて 2 つのストリップに切り取られます。 SLC11A2 (72kD) および β-アクチン (42kD) に対する一次抗体を使用して、これら 2 つのストリップを別々にインキュベートしました。元のウェスタンブロットを補足図S1に示します。過剰発現プラスミドとネガティブコントロールプラスミドは、Yuanjing Biotechnology (広州、中国) によって設計および合成されました。ノックダウン si-RNA とネガティブコントロール si-RNA は、Qingke Biotechnology (中国、広州) によって設計および合成されました。 OVCAR8 細胞を 10 cm ディッシュで培養し、コンフルエンスが 80% に達した時点で消化された細胞をグループに分けました。過剰発現プラスミド (OE)、ネガティブプラスミド (NC または WT)、siRNA (KD)、およびネガティブ siRNA (NC または WT) をそれぞれトランスフェクトしました。トランスフェクションの 24 時間後、細胞を再消化し、計数し、ウェルあたり 1000 細胞でプレーティングしました。 10 ～ 14 日間培養した後、ホルマリンで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、乾燥させて写真を撮影しました。 ImageJ ソフトウェアを使用してコロニー形成の面積を計算し、R を使用してデータをカウントおよび視覚化しました。すべての細胞機能実験は、3 つの三重実験で少なくとも 3 回繰り返しました。

SLC11A2 ウェスタンブロット一次抗体: Abclonal (武漢、中国; カタログ: A10231)。

siRNA ターゲット配列: GGAGGAATCTTGGTCCTTA、GTACCTGCATTCTGCCTTA、GAGTGACTTTGCCAATGGA。

qPCR プライマー配列: F、ATCGGCTCAGACATGCAAGAA; R: TTCCGCAAGCCATATTTGTCC。

siRNA を使用して、卵巣がん細胞株 ES2、A2780、および SKOV3 (si-RNA グループ) の SLC11A2 をノックダウンしました。対照グループは、ノックダウン効果のないsi-RNAを使用しました（NCグループ）。各グループに 5 つの複製ウェルを設定し、初期密度はウェルあたり 1000 細胞 (96 ウェルプレート) でした。培養の 1 日目と 5 日目に CCK8 を添加し、2 時間インキュベートして 450 nm での吸光度を検出しました。臨床腫瘍化学療法の状況をシミュレートするために、SLC11A2 がプラチナベースの化学療法に影響を与えるかどうかを調べるためにシスプラチン介入グループ (CIS) も提供しました。

トランスウェル実験を使用して、ES2、A2780、および SKOV3 の遊走能力に対する SLC11A2 の影響を調べました。消化後、細胞を無血清培地中のトランスウェルチャンバーの上部ウェルに添加し、血清含有培地を下部ウェルに添加した。 24 時間の培養後、細胞をメタノールで固定し、PBS で洗浄し、クリスタルバイオレットで染色しました。小さな穴を通過しなかった上層の細胞を拭き取り、風乾し、写真を撮影した。 ImageJ ソフトウェアは、ウェルを通過する細胞の細胞面積を分析しました。すべての細胞機能実験は、3 つの三重実験で少なくとも 3 回繰り返しました。

プラチナは、卵巣がんの第一選択化学療法の基本薬です。 SLC11A2-siRNAおよびNC-siRNAをトランスフェクトした卵巣がん細胞株を培養し、12ウェルプレートに満たし、アポトーシスを誘導するシスプラチンを添加して生体内での化学療法プロセスを模倣しました。５日間培養した後、細胞を消化し、ＰＢＳで洗浄した。アポトーシスは、アネキシン V-FITC/PI アポトーシス検出キットを使用したフローサイトメトリーによって検出されました。最初の行の 3 つのフローサイトグラムは「NC」グループ (ネガティブコントロール siRNA)、2 行目の 3 つのフローサイトグラムは「si」グループ (SLC11A2 ノックダウン siRNA) でした。アポトーシスの総量は、初期アポトーシスと後期アポトーシスの合計です (右側の 2 つの象限)。アポトーシスパーセントの数値は、それぞれ上に青、下に赤で示されています。アポトーシス実験は、３つずつ少なくとも３回繰り返した。

アネキシン V-FITC/PI アポトーシス検出キット: AAT Bioquest (カタログログ: 20092)。

私たちは、2019年から2021年にかけて、中山大学第一付属病院の婦人科手術患者を対象に、任意の患者標本組織を収集しました。パラフィン包埋組織標本には、6 つの正常な卵巣組織、6 つの正常な卵管組織、8 つの原発性高悪性度漿液性卵巣癌、および 3 つの大網高悪性度漿液性癌転移が含まれていました。組織サンプルは固定され、パラフィンに包埋され、切片化され、脱パラフィンされ、水和され、抗原が回収され、一次抗体および二次抗体とともにインキュベートされ、発色後に密封されました。各グループから 2 つのスライスが選択され、各スライスに 2 × および 10 × を使用して記事に掲載されました。

SLC11A2 の発現と化学療法の予後の相関関係を検証するために、2014 年から 2020 年まで中山大学第一付属病院で治療を受けた患者の卵巣がん原発巣の病理学的切片を遡及的に研究しました。タイプは高悪性度漿液性癌、FIGO ステージ III-IV で、治療法には術前化学療法が必要です。除外基準：原発腫瘍が顕微鏡で見つからない、他の悪性腫瘍と合併している、余命に重大な影響を与える他の疾患と合併している、細胞減少手術と術後化学療法の全コースを完了していない、追跡調査ができていない。

上記の条件に従って、有効なデータを持つ合計 68 症例をスクリーニングし、原発性卵巣癌の病理学的切片に対して SLC11A2 免疫組織化学的染色を実行しました。切片染色は、上記のスコアリングシステムを使用してスコア化した。免疫組織化学的スコアは 2 人が独立して採点しました。

SLC11A2 IHC 一次抗体: アブカム (カタログ: ab262715)。

我々は2018年に中山大学第一付属病院で健康な女性9人、卵巣良性病変患者9人、卵巣悪性腫瘍患者9人からそれぞれ27個の治療前血漿サンプルを採取した。すべてのヒト血液サンプルは、中山大学第一付属病院の治験審査委員会の承認とすべての参加者からのインフォームドコンセントを得た後に収集されました。全血サンプルは、真空採血管を使用して絶食参加者から採取されました。収集した血漿を 3000 rpm、4 °C で 10 分間遠心分離し、続いて 12,000 xg で 15 分間遠心分離しました。バックアップのために -80 °C で保管してください。上清を新しい遠心管にバッチ移し、0.22 μm の微多孔膜で濾過します。タンパク質抽出後、トリプシンを使用してペプチドを中絶に消化しました。生成された MS/MS データは、MaxQuant 検索エンジン (v.1.5.2.8) (Max Planck Institute for Biochemistry、ミュンヘン、ドイツ) を使用して処理されました。タンデム質量スペクトルは、リバースデコイデータベースにリンクされた SwissProt ヒトデータベースに対して検索されました。

次に、2020年から2021年にかけて中山大学第一付属病院と厦門大学第一付属病院で卵巣腫瘍と健康な女性ボランティアから血清を採取した。対照群には健康な女性、術後卵巣がん患者、境界線卵巣腫瘍患者、良性卵巣病変患者、結腸がん患者を含む33のサンプルがあった。未治療の卵巣がん患者と再発が確認された卵巣がん患者を含む合計48人のサンプルが実験グループに含まれた。

血清 SLC11A2 濃度は、SLC11A2 Elisa Avidin キットを使用して測定しました。 MyCurveFit Web ツール (https://mycurvefit.com/) を使用して、Elisa 標準フィット曲線を描画し、曲線の式を計算します。測定されたタンパク質濃度を臨床診断と組み合わせて、受信者動作特性 (ROC) 曲線を取得しました。

溶質キャリアファミリー 11 メンバー 2 用の ELISA キット: EIAAB Science Inc、武漢 (カタログ: E0316h)。

ソフトウェア: R (バージョン 3.6.3) (統計分析および視覚化)。

R パッケージ: pROC パッケージ [1.17.0.1] (分析用)、ggplot2 パッケージ [3.3.3] (視覚化用)。

すべてのプロジェクトはそれぞれの倫理委員会から承認を得ました。中山大学第一付属病院の倫理委員会（倫理承認 NO. 308-2016-03-01、NO483-2021-6-28）。すべての標本は患者の同意と許可を得て取得されました。すべての方法は、関連するガイドラインと規制に従って実行されました。

Oncomine データベースには、複数のソースからの研究データが含まれています。図1aでは、赤い四角はそのがんにおけるその遺伝子の高い転写レベルを表し(p < 0.0001)、青い四角はそれぞれそのがんにおけるその遺伝子の低い転写レベルを表します(p < 0.0001)。ボックス内の数字は、その傾向を裏付ける研究の数を表します。 Oncomine データベースは、SLC11A2 mRNA が正常組織と比較して脳および中枢神経系の腫瘍、リンパ腫、結腸癌、白血病で高レベルで発現していることを示しています。がん組織と比較して、卵巣がん組織では SLC11A2 mRNA 発現が上昇していました。 (図1a)。さらに、GEPIA2ツールを使用してプールされたTCGAおよびGTExデータから取得した発現データを使用して、33のヒト癌とその正常組織間のSLC11A2発現を分析しました（図1b）。 GENTデータベースでは、副腎がん、膀胱がん、骨がん、乳がん、子宮内膜がん、結腸がん、肺がん、リンパ腫、前立腺がん、胃がん、卵巣がんなどのいくつかのがん種でSLC11A2発現が上方制御されていました（図1c）。 2 つの独立した GENT マイクロアレイプラットフォームからのデータは、SLC11A2 転写レベルが正常卵巣組織と比較して卵巣癌において有意に増加していることを示しました (GPL570、P < 0.001、Log2FC = 0.207; GPL96、P < 0.001、Log2FC = 0.399)。結果は、SLC11A2 の発現が正常組織と比較してさまざまな種類の癌で大幅に増加していることを示しています。卵巣癌組織におけるSLC11A2 mRNAの発現レベルは、3つのデータベースでより高かった(図1、赤いボックスで示される)。 p < 0.001 を閾値として設定し、2 つの GENT マイクロアレイデータを交差させて、血液がん、乳がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がんでは転写レベルが上昇し、腎臓がんでは転写レベルが低下した SLC11A2 mRNA を取得しました。 (補足表 S1a、b)。

さまざまな種類の癌における SLC11A2 mRNA の発現。 (a) 比較は、正常組織と比較したがんにおける SLC11A2 mRNA の過剰発現 (左の列、赤) と過小発現 (右の列、青) のデータセットの数を示しています。このグラフ表示は Oncomine データベースから得られたもので、閾値は次のパラメーターを使用して設計されています: p 値 1E-4、倍数変化 2、および遺伝子ランク 10%。（b）GEPIA2による33のヒト癌におけるSLC11A2の発現：すべての腫瘍サンプルおよび対の正常組織の遺伝子発現プロファイルをドットプロットとして表示。各点はサンプルの表情を表します。 (c) 腫瘍および対応する正常組織における SLC11A2 mRNA の発現パターン: さまざまながんにおける SLC11A2 mRNA の発現に関する GENT2 から取得。ボックスは中央値、25 パーセンタイル、75 パーセンタイルを表します。点は外れ値を表します。赤いボックスは腫瘍組織を表し、緑のボックスは正常組織を表します。統計的方法: 2 サンプル T 検定。

CbioPortal データベースによると、卵巣漿液性癌における SLC11A2 遺伝子のゲノム変化率は 1% であることがわかりました。これは、鉄輸送の重要な分子として、SLC11A2 がゲノム内で比較的保存されていることを示しました。次のヒートマップは、卵巣がんにおける SLC11A2 の発現レベルを示しています (図 2a)。 TCGAデータベースからの卵巣癌組織とGTExデータベースからの正常卵巣組織の組み合わせ分析により、卵巣漿液性癌におけるSLC11A2 mRNAレベルの上昇が明らかになりました（図2b、補足表S2）。卵巣がんの予測因子として組織SLC11A2 mRNA転写レベルを使用すると、曲線下面積AUCは0.749、信頼区間CIは0.708〜0.791でした（図2c）。すなわち、切除卵巣組織のSLC11A2 mRNA転写レベルをマーカーとして良悪性を判定する精度は74.9%であった。これは、卵巣がんのバイオマーカーとしての可能性を示しています。

卵巣がんにおける SLC11A2 mRNA およびタンパク質の発現。 (a) 卵巣漿液中の SLC11A2 遺伝子のゲノム変化率。 (b) TCGA と GTEx を組み合わせた、卵巣漿液性癌における SLC11A2 mRNA。統計的方法: Wilcoxon 順位和検定。（統計的P値は星印で表す：*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、以下同様）。 (c) 卵巣癌診断のための SLC11A2 mRNA の ROC (受信者動作特性) 曲線。 (d) 正常卵巣組織および卵巣漿液性癌組織における SLC11A2 タンパク質の IHC (免疫組織化学) (The Human Protein Atlas; https://www.proteinatlas.org/)。

Human Protein Atlas データベースの免疫組織化学染色により、SLC11A2 タンパク質が卵巣漿液性癌で高度に発現され、正常な卵巣組織では発現されないことが示されました。卵巣がんにおけるタンパク質発現と mRNA 転写レベルの傾向は一貫していました。上皮性卵巣癌の 3 つの主要な病理学的分類が図に示されており、統計分析により、卵巣癌では SLC11A2 タンパク質の発現が大幅に増加していることが示されています。 (図 2d、P < 0.001)。

Kaplan-Mayer プロッター Web ツールを使用して、4 つの異なるプローブマトリックスに対応する卵巣癌における SLC11A2 の mRNA 発現を取得しました。 4 つの行列は、203123_s_at (SLC11A2)、203124_s_at (SLC11A2)、203125_x_at (SLC11A2)、210047_at (SLC11A2) であり、ケースは各プローブと一致していました (n = 1435)。 SLC11A2 転写レベルは高発現グループ (赤) と低発現グループ (黒) に分けられ、無増悪生存期間 (PFS) が予後の代用となりました。 X 軸は PFS 時間、Y 軸は生存確率です。 4 つのアレイすべてで、SLC11A2 発現が高い卵巣がん患者は、発現が低い卵巣がん患者よりも無増悪生存期間 (PFS) が短く (P = 0.0044、0.0086、0.015、0.000016; HR = 1.21、1.19、1.19、1.35)、中央値が短いことが示されました。生存期間も大きく異なりました：1.73〜4.78か月（図3a〜d;補足表S3）。

SLC11A2 と卵巣癌の予後との関係。細胞シグナル伝達経路濃縮分析。（a〜d）SLC11A2 mRNA発現の高および低に対するカプラン・マイヤーPFS曲線。 (f – i) SLC11A2 と卵巣がんの臨床的特徴との相関。 (j) SLC11A2 発現と正の相関がある遺伝子の上位 10 個。 (k) 卵巣癌における SLC11A2 共発現遺伝子濃縮分析。 (メタスケープツール)。

臨床的特徴と発現の間の関係は、UALCAN データベースから取得されました。卵巣がん SLC11A2 mRNA と、FIGO 病期、民族性、TP53 変異状態、年齢、および病理学的分化の程度との相関関係 (図 3e-i) により、以下のことが示されました。 SLC11A2 は、民族性、アジア人卵巣がんにおいてのみ有意に異なっていました。患者は SLC11A2 mRNA 発現が低かった。これは、この分子に関する現地の研究が必要であることを意味します。

ヒートマップは、卵巣嚢胞腺癌における SLC11A2 発現と正の相関があった上位 10 遺伝子を使用して描画されました (図 3j、補足表 S4)。これらの分子は、SLC11A2 のタンパク質相互作用に関するその後の研究の手がかりを提供する可能性があります。遺伝子オントロジーおよびシグナル経路分析により、共発現された分子の高い割合がアポトーシスシグナル伝達経路、免疫応答の負の制御、およびTP53による転写制御で機能することが示されました（図3k）。

コロニー形成の結果は、SLC11A2過剰発現後に細胞の生存率と複製効率が大幅に改善されたことを示しました（図4a〜c; P = 0.002）。さらに実証するために、siRNA を使用して SLC11A2 の翻訳を特異的に阻害し、それをネガティブ si-RNA コントロールと比較しました。ノックダウン効率はウェスタンブロットによって検証されました（図4d;元のブロットは補足図S1に示されています）。結果は、SLC11A2のノックダウンが卵巣がん細胞の生存率と複製効率を大幅に改善することを示しました（図4e、f; P = 0.006）。細胞クローン形成実験により、SLC11A2の発現レベルが生存率および複製率と正の相関があることが示されました。

卵巣がん細胞株のコロニー形成に対する影響。 (a) 過剰発現効率の検出: 野生型 (WT) 対過剰発現 (OE)。 (b) コロニー形成の定量化 (OE vs WT)。統計的方法: 独立したサンプルの t 検定。 (c) コロニー形成の画像。 (過剰表現)。 (d) ウェスタンブロット、SLC11A2、およびβ-アクチンによるノックダウン効率の検証。ブロットは、一次抗体ハイブリダイゼーションとのインキュベーション前に切り取られました。元のブロットは補足図S1に示されています。（ e ）コロニー形成の定量化、野生型（WT）対ノックダウン（KD）。統計的方法: 独立したサンプルの t 検定。 (f) コロニー形成（ノックダウン）の画像。

A2780、ES2、および SKOV3 の CCK8 細胞生存率アッセイでは、SLC11A2 をノックダウンした後に A2780 細胞の生存率が増加することが示されました。ただし、ES2 細胞と SKOV3 細胞の生存率は減少しました。この傾向は、培地へのシスプラチンの添加によって影響を受けませんでした（図５ａ）。

細胞の生存率と遊走に対する SLC11A2 ノックダウンの影響。 (a) CCK8 アッセイによるシスプラチンで処理した細胞生存率。統計的方法: 独立したサンプルの t 検定。 (b) トランズウェル遊走アッセイの画像。 (NC 対 siRNA)。 (c) トランスウェル遊走アッセイの定量化。統計的方法: 独立したサンプルの t 検定。

トランスウェル細胞遊走アッセイは、SLC11A2の発現レベルが卵巣がん細胞株の遊走能力と正の相関があることを示しました（図5b、c）。 SLC11A2 をノックダウンすると、卵巣がん細胞の遊走能力が大幅に阻害される可能性があります。

SLC11A2 をノックダウンした細胞生存率実験では、SKOV3 細胞株が生存率の最大の低下を示したので、さらなる研究のために SKOV3 細胞株を選択しました。シスプラチンによって誘導されるSKOV3細胞のアポトーシス率を計測したところ、SLC11A2のノックダウンにより、一定濃度のシスプラチンによって誘導される卵巣がんアポトーシスの割合が大幅に増加することが結果からわかりました（図6a、b）。

SLC11A2 ノックダウンにより、SKOV3 細胞株のシスプラチン感受性が増加しました。 (a) skov3 細胞のアポトーシスのフローサイトメトリープロット。アポトーシスの総量は、初期アポトーシスと後期アポトーシス (右 2 つの象限) でした。これは、3 回の独立した反復実験の代表的なプロットです。 (b) アポトーシスの割合の棒グラフ。統計的方法: ウェルチの t 検定。

免疫組織化学的結果は、SLC11A2 タンパク質が卵巣漿液性癌原発巣、大網転移、および正常な卵管粘膜において強い陽性であることを示しました。正常な卵巣および卵管の他の部分では完全に陰性。これは、mRNA 転写レベルとは多少異なります。正常な卵巣では、SLC11A2 mRNA は一定レベルの転写を持っていますが、免疫組織化学により、このタンパク質が正常な卵巣には分布していないことが示されました。卵管におけるその分布も明らかに特異的であり、卵管粘膜でのみ高度に発現されます。すべての標本は一貫しています。そのうちの 2 つは図では個別に示されています。この図は、組織マイクロアレイデータベース (図 7a) とは異なる卵管の拡大図と断面図を示しています。

SLC11A2 免疫組織化学的分析。 (a) 4 つの組織タイプにおける SLC11A2 タンパク質の分布: 正常卵巣、正常卵管、卵巣高悪性度漿液性癌、および大網転移を伴う卵巣癌の病理学的切片。各組織タイプの 2 つのサンプルが選択され、各サンプルは 2 つの倍率で行われました。 (b) 原発性卵巣癌における SLC11A2 タンパク質の発現と予後との関係 (IHC、n = 68)。統計的方法: コックス回帰分析。

遡及的免疫組織化学研究では、原発腫瘍で SLC11A2 発現が高い患者の OS と PFS が短いことが示されましたが、この傾向は統計的に有意ではありませんでした (OS、P = 0.302、HR = 1.51; PFS、P = 0.739、HR = 1.15)。曲線とHR値から、SLC11A2タンパク質の発現が低い患者は、PFSよりもOSにおいて明らかな利点を持っています（図7b）。統計的有意性の欠如は、サンプルサイズが小さいことに関連している可能性があります。この研究コホートの臨床ベースライン情報は補足表 S5 にあります。

SLC11A2 濃度で検出および定量されたのは、27 個の血漿エクソソームサンプルのうち 8 個だけでした (図 8a)。卵巣がん患者の血漿エキソソーム中の SLC11A2 タンパク質の相対濃度値は、健康な良性卵巣疾患群の値よりも有意に高かった。検出率とコストを考慮して、大量の血液サンプルを検出するために Elisa キットを使用しました。この研究コホートの臨床ベースライン情報は補足表 S6 にあります。

卵巣がん患者の血清における SLC11A2 の発現。 (a) 液体クロマトグラフィー質量分析法を使用した、卵巣がん患者の血漿エクソソーム中の SLC11A2 タンパク質濃度の検出。統計的方法: 一元配置 ANOVA 検定。 (b) 血清中の SLC11A2 の濃度は Elisa キットで検出されました。統計的方法: 一元配置 ANOVA 検定。 (c) 卵巣がんを検出するための血清中の SLC11A2 の受信者動作特性 (ROC) 曲線。最適なカットオフ値と曲線下面積 (AUC) が図に示されています。

ELISAの結果は、卵巣がんの負担が大きい患者（未治療で再発）の血清SLC11A2濃度が、卵巣がんの負担のない女性よりも有意に高いことを示しました（図8b）。受信者の動作曲線は、卵巣がんの最良のカットオフ値を示しました。卵巣癌と非卵巣癌の区別は、59.579 pg/ml、曲線下面積 (AUC) は 0.8 でした。これは、SLC11A2 が卵巣癌の血清学的マーカーとして機能する可能性があることを意味します (図 8c)。

卵巣がんは依然として婦人科腫瘍の中で最も死亡率の高い悪性腫瘍です18。卵巣は骨盤の深部に位置するため19、卵巣がんには明らかな症状はなく、診断された患者のほとんどは進行期（FIGO III-IV期）20であり、卵巣は病気の進行が速い腹部臓器です。統計 21 によると、卵巣がんの 5 年生存率は、ステージ I で 76 ～ 93%、ステージ II で 60 ～ 74%、ステージ III で 23 ～ 41%、ステージ IV で 11% です。卵巣がんを治すには、早期診断と治療選択肢の改善が鍵となります。前者は体液検査と画像検査に依存します。後者は、手術による治癒率の向上が限界に近づいていると同時に、ほとんどの卵巣がんが放射線療法に感受性がないため、抗腫瘍薬の革新に依存しています。私たちの研究は、卵巣がんの新しい分子診断マーカーと治療標的を見つけることを目的としています。 SLC11A2 は、細胞内の鉄輸送を担うタンパク質です 22。現在の研究のほとんどは、鉄過剰の造血系におけるこの分子の役割に焦点を当てています。近年まで、この分子に関するいくつかの癌関連の研究が報告されてきました。 SLC11A2 の癌促進の役割は結腸癌と乳癌で実証されており、我々の注目を集めました 23。

生存分析では、卵巣がん患者においてSLC11A2 mRNA高発現群は低発現群よりも予後が悪いことが示され、4つのアレイの結果は同様であった。 PFS リスク率 (HR) の範囲は 1.19 ～ 1.35 です。 HR は見た目ほど高くありませんが、卵巣癌巣のほとんどが免疫組織化学的結果でびまん性に発現しており、正常な卵巣が完全に陰性であることを考慮すると、SLC11A2 が卵巣癌の大部分で高度に発現していることが示されました。このような高い発現の場合、発現レベルの微妙な違いによる予後効果は十分に明らかではありません。

4 つのチップに対応する MST (生存期間中央値) の差を計算したところ、それぞれ 4.78 か月、3.57 か月、4.44 か月、1.73 か月でした。比較すると、すべての卵巣がんに対する現在の PARP 阻害剤維持療法でさえ、生存期間中央値は 12.9 か月延長するだけで、死亡リスクは 26% 減少し、5 年生存率は 9% 改善します 24 (SOLO2)25。このように、治療標的としての SLC11A2 の利点は非常に大きいです。

臨床的特徴のサブグループ分析により、いくつかの傾向が明らかになりましたが、人種的表現における P 値のみが有意に異なりました。これは、アジア人と他の人種の間の人種差別表現がより顕著であることを示しています。この目的のために、私たちはその後、アジアの患者から実際のデータを得るために血液と組織のサンプルを収集しました。

我々の CCK8 細胞増殖アッセイでは、A2780 細胞株と他の細胞株は SLC11A2 の調節に対して逆に反応しました。これは、浸潤性乳がん細胞株 MB231 と非浸潤性乳がん MCF-7 を、培地の鉄濃度を下げるためにデフェロキサミン (DFO) とともに別々に培養した、乳がんにおけるヒトに関する以前の研究 26 に似ています。 MB231 細胞質およびミトコンドリア内の鉄濃度の増加により、細胞増殖が促進されました。一方、細胞質およびミトコンドリアの鉄濃度が低下すると、MCF-7 細胞株の生存率が低下しました。これは、異なるがん細胞が鉄調節に対して異なる反応を示すことを示しており、これは鉄調節関連分子をがん治療標的とする場合に考慮する必要がある重要な点でもあります。

白金アルキル化剤ベースの化学療法は卵巣がんの第一選択化学療法であるため、卵巣がん細胞に対する SLC11A2 ノックダウンの効果を検出するための誘導剤としてシスプラチン (白金化学療法薬) を使用しました。上記の GO 解析ではアポトーシス経路が最初にランク付けされたため、最初に SLC11A2 ノックダウンとシスプラチンの細胞増殖阻害効果を検出し、次にアポトーシス率を検出ターゲットとして選択しました。臨床的には、プラチナベースの化学療法の副作用と薬剤耐性は、有効性と再発に影響を与える重要な要素です。 SLC11A2 のノックダウンは、プラチナ誘発がんアポトーシスを顕著に促進する効果があり、臨床現場でのプラチナの用量を減らし、副作用や薬剤耐性の再発を減らすことが可能になります。

免疫組織化学的染色の結果は予想外で刺激的なものでした。トランスクリプトームシーケンスの結果によると、正常な卵巣組織における SLC11A2 の転写物は低くはありませんでした。しかし、SLC11A2 タンパク質は、すべての正常な卵巣の免疫組織化学的染色では検出されませんでした。正常な卵管粘膜は強い陽性でしたが、筋肉、間質、漿膜は陰性でした。粘膜層は背の高い円柱状細胞の単層で構成されており、排卵と受精に重要な役割を果たしています。どの種類の粘膜層細胞がこのような高レベルの SLC11A2 を発現しているのかはまだわかっていません。この発現パターンは、卵巣癌の高悪性度漿液性癌に関して近年学会によって提案された卵管起源説を裏付けるものである27、28。進行卵巣癌の免疫組織化学的予後曲線は、SLC11A2発現が高い患者のOSが短いことを示している。サンプルサイズは限られていましたが、曲線の傾向は非常に明白でした。

同時に、SLC11A2は卵管粘膜において鉄輸送タンパク質として機能し、卵管内腔内の低鉄濃度環境を維持するという仮説を提案します。月経血は、出産適齢期の女性の卵管内腔に入り、マクロファージによって除去されます。輸送手段がなければ、尿細管内マクロファージに取り込まれた鉄は卵管液中で高濃度の鉄を形成し、卵管壁に沈着し、排卵と受精のプロセスを妨げる可能性があります。研究 29、30 では、卵管内腔内の鉄イオン濃度がマクロファージと精子の両方に影響を与えることが示されています。 SL11A2 は、鉄イオンを卵管の外に輸送して正常な卵管液環境を維持し、排卵と受精を促進する分子です。 SLC11A2 は、不妊治療の期待に加えて、将来的には病理学者によって卵巣腫瘍の原因を特定するために応用される可能性があります。

卵巣がんに対する実行可能な予防策がない場合、早期診断は死亡率を低下させる重要な方法です。エクソソームは、過去 10 年間、研究のホットスポットとなってきました。私たちは、液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS) のために 27 人のペアの患者から血漿エクソソームを抽出しました。 SLC11A2 タンパク質の定量化に成功したのは 8 例だけでしたが、有意な差を示すには十分でした。エクソソーム抽出と HPLC-MS のコストは短期間では依然として高いため、この技術の臨床応用は制限されています。同時に、質量分析の検出率が低いという問題を解決するために、アビジン増幅効果を備えた Elisa キットを試しました。 SLC11A2 を検出するためにこの方法のキットと検査キットを使用した人がいることを示す文献はないため、キットの安定性を証明するにはさらに多くの実験が必要です。入手可能な証拠は、たとえ独立した診断指標にはなれないとしても、全体的な検出率の向上に役立つ複合診断指標となることが期待されることを示しています。

この研究は、卵巣癌組織における SLC11A2 mRNA およびタンパク質の発現が高いと予後が悪化する傾向があることを示しました。 SLC11A2 をノックダウンすると、卵巣がん細胞におけるシスプラチン誘導性のアポトーシスが増加しました。この研究は、SLC11A2 が卵巣がんの潜在的な治療標的および複合診断バイオマーカーである可能性があることを示唆しています。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

卵巣がん

溶質キャリアファミリー 11 メンバー 2

がんゲノムアトラス

遺伝子型と組織の発現

遺伝子発現プロファイリング対話型解析

生存時間の中央値

高悪性度漿液性卵巣がん

曲線下の面積

信頼区間

ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ

正常組織および腫瘍組織における遺伝子発現

国際産婦人科連盟

ハザード比

遺伝子多重結合ネットワーク統合アルゴリズム

遺伝子セット濃縮分析

プログラムされたデスリガンド 1

ネガティブコントロール

過剰発現

野生型

ノックダウン

細胞計数キット-8

形

受信機動作特性

トランスフェリン

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研究にご協力いただいた患者様に心より感謝申し上げます。

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2022YFC2704200)、中国国家自然科学財団 (NO. 81772769; NO. 81903037)、および中国広東省自然科学財団 [NO. 81903037] によって支援されました。 2020A1515011281]。

Liming Tian と Xuemei Li という著者も同様に貢献しました。

中山大学第一附属病院産婦人科、No. 58, Zhongshan Road II, Guangzhou, 510080, China

Liming Tian、Huiling Lai、Tingting Sun、Xiaohui Li、Linxiang Wu、Chuling Wu、Shuzhong Yao、Guofen Yang

中国、済南市、山東大学（青島）斉魯病院婦人科

ティアン・リミン

厦門大学第一附属病院検査医学科、厦門大学医学部、厦門主要遺伝子検査研究所、厦門大学、厦門、361005、中国

リー・シュエメイ

中国、広州、中山大学第 6 関連病院婦人科

ライ・ホイリン

中国広州中山大学第一附属病院放射線治療科

ユフェン・レン＆シャシャ・ヘ

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LT は、バイオインフォマティクス分析、細胞実験、免疫組織化学、結果の解釈、および原稿執筆を担当します。 XL はいくつかの血清サンプルを提供し、ELISA 実験を指導して参加し、原稿執筆にも参加しました。 HL はエクソソームの検出と提出のガイダンスを担当します。 TS、LW、CW、XL は実験指導とサンプル収集を担当します。 SY、YR、SH、GY は財政的支援と仕事の調整を提供しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。すべての検体と臨床データは患者の同意と許可を得て取得されました。

Shasha He または Guofen Yang への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Tian、L.、Li、X.、Lai、H. 他。 SLC11A2: 卵巣がんにおける有望なバイオマーカーおよび治療標的。 Sci Rep 13、1132 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26789-5

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受信日: 2022 年 6 月 23 日

受理日: 2022 年 12 月 20 日

公開日: 2023 年 1 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26789-5

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