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May 03, 2023

遺伝的に多様な多品種の取得と運搬

medicina della comunicazione

コミュニケーション医学第 3 巻、記事番号: 79 (2023) この記事を引用

166 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この詳細なゲノム研究では、リソースの少ないアフリカの病院における 2 kg 未満の新生児とペアの母親における多剤耐性グラム陰性桿菌 (MDR-GNB) 保菌を特徴付けました。

この横断コホート研究は、ガンビアの新生児紹介施設で毎週新生児の皮膚と肛門周囲のサンプリングと、一対の母親の直腸膣綿棒を使用して実施されました。 前向き細菌培養には、API20E および API20NE による種同定を行った MacConkey 寒天培地を使用しました。 すべての GNB 分離株は、Illumina Miseq プラットフォームで全ゲノム配列決定を受けました。 多座位配列タイピングと SNP 距離分析により、株の種類と関連性が特定されました。

34 人の新生児と 21 組の母親から採取した 135 個の綿棒から 137 個の GNB 分離株が得られ、そのうち 112 個が高品質の de novo アセンブリでした。 新生児の MDR-GNB 保菌率は入院時に 41% (14/34) で、7 日までに 85% (11/13) が新たに獲得されました。 複数の MDR および ESBL-GNB 種が異なる時点で保有されており、最も頻度が高いのは肺炎桿菌と大腸菌であり、株の多様性は不均一であり、クローン性の証拠はありません。 111 の異なる抗生物質耐性遺伝子のほとんどはベータ ラクタマーゼです (Bla-AMPH、Bla-PBP、CTX-M-15、Bla-TEM-105)。 母親の 76% (16/21) と 62% (13/21) の直腸膣内保菌は、それぞれ MDR-GNB および ESBL-GNB が 1 以上であり、ほとんどが MDR-E です。 大腸菌 (76%、16/21) および MDR-K。 肺炎 (24%、5/21)。 21 の新生児と母親の 2 人組のうち、遺伝的に同一の分離株を持つのは 1 つだけです (大腸菌 ST131 および肺炎桿菌 ST3476)。

ガンビアの入院新生児は、出生から7日目までに感染し、高いMDRおよびESBL-GNB保菌率を示しているが、母親から新生児への感染を裏付ける証拠は限られている。 感染をさらに理解し、対象を絞った監視および感染予防政策に情報を提供するには、同様の環境でのゲノム研究が必要です。

複数の抗生物質に耐性のある細菌は、資源の少ない国では新生児、特に病院で生まれた小さな赤ちゃんや未熟児の感染と死亡の重要な原因となっています。 これらの耐性菌が新生児の皮膚や腸内でどのようにして獲得されるのか、特に母親から一般的に感染するかどうかは不明です。 私たちは、細菌の種類、抗生物質耐性の量、影響を受けた新生児と母親の数、新生児と母親の間でのこれらの細菌の類似性を理解するために、ガンビアの小さな新生児とその母親に存在する細菌を研究しました。 私たちは、多くの新生児がこれらの細菌を保有しているにもかかわらず、それらは母親の中に存在する細菌とは異なることを発見しました。 これは、細菌が病院環境から取得されたことを示唆しています。 私たちの研究は、病院で脆弱な入院新生児による細菌の感染を減らすために、病院内でそのような細菌の存在を特定して減らすための戦略を開発することの重要性を強調しています。

アフリカやアジアの多くの国では新生児死亡率が依然として容認できないほど高く、5 歳未満の子供の死亡率の 47% を占めています1。 侵襲性感染症は新生児死亡の重要な原因となっており、アフリカでは負担が大きく、死亡率の相対リスクも高い2,3。 早産（在胎 37 週未満）および/または低出生体重（LBW; 2.5 kg 未満）で生まれた小さな脆弱な新生児は、自然免疫および適応免疫の障害 4、長期の入院、および侵襲的処置 5 により、感染症のリスクが最も高くなります。 腸壁を横切る転座を伴う病原体の腸内保菌は遅発性感染症や炎症性疾患と関連しており 6、未熟児の皮膚の完全性は通常損なわれており、これが侵襲性感染のさらなる経路となります。

敗血症に関連した年間新生児死亡数 690,000 人のうち、推定 31% は抗菌薬耐性 (AMR) が原因である可能性があります 7。 グラム陰性菌 (GNB) の中で、エンテロバクテラル目はアフリカの新生児における重篤な細菌感染症の主な原因であり 2,8,9 、最も一般的には肺炎桿菌と大腸菌が関係しています。 アフリカでは侵襲性新生児GNBの最大82%に多剤耐性（MDR）が見られ10,11、有病率は増加しており11、診断や治療の選択肢が限られているため管理が課題となっている7。 拡張スペクトラム ベータ ラクタマーゼ（ESBL）を産生する GNB は、2017 年に世界保健機関によって研究と抗生物質開発の優先度が高い病原体としてリストされ 12、新生児死亡率を削減するという世界的な目標を掲げる場合に対処することが極めて重要な新生児公衆衛生上の緊急事態を表しています。出生数 1000 人中 12 人以下は 2030 年までに達成される予定です13。

新生児の MDR-GNB 保菌は侵襲性血流感染症と関連している 14,15,16 が、資源が限られた環境 (RLS) の病院内で新生児がどのように MDR-GNB を獲得するかについての詳細な理解は限られています。 LBW17、長期入院、抗生物質の使用は新生児 MDR-GNB 獲得の危険因子 18 であり、新生児 ESBL-GNB 保菌と早産との関連性が報告されている 19。 さらに、入院中の未熟児の腸内定着パターンは、健康な正期産の母乳で育てられた乳児の腸内定着パターンとは異なりますが、最低のリソース設定からの在胎週数固有のデータが不足しており、ほとんどのデータは感染予防管理と医療システムが確立されている HIC 設定から得られています。文脈が異なります。 アフリカの新生児病棟における MDR-GNB の環境起源も報告されており 20、汚染された液体、抗生物質のバイアル、機器および表面がアウトブレイクに関与し関連しているとされています 21,22。 母親の定着は、新生児の感染および B 群連鎖球菌などのグラム陽性菌感染の危険因子であることがよく知られています 23。 しかし、特にアフリカでは、新生児の MDR-GNB 獲得における母親の定着の役割は厳密な精査を受けておらず 24、垂直感染と水平感染の相対的な寄与は不明です 25。 これは、新生児 MDR-GNB 保菌とそれに続く浸潤性感染を減らすための、標的を絞った感染予防制御戦略の開発において対処すべき重要なギャップです。

この研究は、資源の少ないアフリカの新生児病棟（NNU）における、脆弱な小さな新生児におけるMDR-GNB保菌の特徴を明らかにすることを目的としており、全ゲノム配列決定（WGS）を用いて母体保菌に関連した獲得を探求した。 目的には以下が含まれる： 1) 新生児およびペアの母親の種特異的な MDR-GNB および ESBL-GNB 保菌率を決定する。 2) 菌株特異的な肺炎桿菌および大腸菌の保菌について説明できる。 3) 抗生物質耐性遺伝子を説明すること、および 4) 新生児と母親の二者関係における肺炎桿菌と大腸菌分離株の関連性を調査すること。

要約すると、我々は、NNU 入院後 24 時間以内の脆弱な小型新生児における MDR および ESBL を生成する GNB の保菌率が高く、入院 7 日以降に広範な感染が確認された。 複数の MDR および ESBL-GNB 種が、さまざまな時点で個々の新生児に存在しており、最も一般的なのは肺炎桿菌と大腸菌です。 不均一な株の多様性があり、クローン性の証拠はなく、広範囲の AMR 遺伝子、最も一般的にはベータラクタマーゼが存在します。 母子感染におけるMDR-GNB（主に大腸菌）の感染率は非常に高い。 しかし、肺炎桿菌と大腸菌の両方について遺伝的に同一の株の証拠を持っている新生児と母親の二組は 1 つだけです。 これらの結果は、この環境における新生児の感染には複数の環境源が重要な役割を果たしていることを示唆しているが、感染を完全に理解し、対象を絞った監視および感染予防政策に情報を提供するには、さらなるゲノム研究が必要である。

この横断コホート研究は、早期カンガルーマザーケア（KMC）が脆弱な小さな新生児の生存に及ぼす影響を調査する臨床試験の計画を知らせるための実現可能性研究の一環として、2017年4月から8月にかけて実施された26。

募集はガンビアの国立新生児紹介ユニット（バンジュールのエドワード・フランシス小規模教育病院（EFSTH））で行われた。 年間約 1,400 人の新生児が入院しています27。内生まれ（病院で年間約 6,000 人の出生）と外生（他の医療施設または自宅）の人口が混在しています。 ガンビアの新生児死亡率は、1990 年から 2018 年の間に出生 1,000 人あたり 49 人から 26 人に減少しました [1] が、依然として SDG 3.2 の目標である出生 1,000 人あたり 12 人を大幅に上回っています。 ガンビアの新生児の 12% が早産で生まれ 28、LBW1 が 17%、新生児死亡の 28% が感染症によるもので 29、小さな新生児の死亡率に対する感染症の寄与が過小評価されている可能性があります。

EFSTH における入院患者の致死率は、2010 年から 2014 年にかけて 2 kg 未満の新生児で 35% (すべての入院) から 48% の範囲であり、未熟児または LBW が全入院の 27% を占めました 27。 この研究の時点では、WHO レベル 2 の新生児ケアには、濃縮器による酸素供給、光線療法、輸血および点滴（IV）輸液が提供されていました。 経験的な第一選択の抗生物質はアンピシリンとゲンタマイシンの静注（年齢<72時間）で、市中発症と院内感染（HAI）の疑い（年齢72時間以上）の両方にはセフトリアキソンとフルクロキサシリンが使用されました。 シプロフロキサシンは、カルバペネムの第二選択治療薬であり、ほとんど入手可能ではありませんでした。 死後解剖、血液培養、C反応性タンパク質、その他の感染バイオマーカーは入手できなかったため、このコホートにおける敗血症の有病率や死亡率への寄与は不明である。 入院率は、静かな乾季（1 月から 8 月）には 1 か月あたり 80 ～ 100 人の新生児、雨季（9 月から 12 月）には 140 ～ 160 人の新生児でした 27。

研究期間中（2017年4月から7月）に入院した体重2kg以下のすべての新生児は、体重<2kg、入院年齢<24時間という包含基準で適格性についてスクリーニングされた。 スクリーニング前もしくはスクリーニング中に死亡した場合、あるいはインフォームドコンセントがなかった場合には、新生児は除外された。 皮膚スワブの具体的な除外基準には、出生時から皮膚に適用されている局所抗生物質またはステロイド、およびスワブ部位から 4 cm 以内の全身性または局所的な皮膚疾患が含まれます 30。 肛門周囲スワブの除外基準には、穴の開いていない肛門または肛門狭窄、以前の胃腸手術または過去 24 時間 30 分以内の下痢が含まれていました。 母親には、直腸膣（RV）スワブが入手可能になったら提供する同意を求めました。ただし、既知の HIV 感染、過去 5 年以内の大規模な胃腸手術、過去 24 時間以内の下痢または便秘、または現在の性感染症がある場合は除外されます。 参加者の識別は一意の識別番号を使用して擬似的に匿名化され、身元は研究者のみが知っています。

新生児スワブ、人体測定データおよび臨床データ、在胎週数評価 (New Ballard スコア 31)、抗生物質の使用および院内転帰は、直接観察、保護者との面談、および入院後できるだけ早く、その後毎週 (7 日目、14 日目、 21、28）退院または死亡するまで。 データは、REDCap™ を使用して電子的に記録されました。 新生児の皮膚スワブは、剣状胸骨および臍周囲領域からの複合サンプリングによって得られました。 侵襲性が低いサンプリングのため、腸管輸送用の便または直腸サンプルの代わりに肛門周囲サンプルが採取されました 32。 RV サンプルは、同意した母親から混合綿棒として採取されました。 すべてのサンプルは、訓練を受けた職員によって FLOQ® 綿棒を使用して採取され、ガンビアの医学研究評議会（ファジャラ市ロンドン衛生熱帯医学大学院 MRCG）に移送される前に、アミーズ輸送培地で +4 ～ +8 °C で保存されました。ガンビア、48時間以内。

分離株の将来の細菌学的処理と保管はすべて、ISO-15189 認定の臨床検査機関である MRCG で行われました。 サンプルは、35 ～ 37 °C で好気的にインキュベートされた MacConkey 寒天プレート上で培養することによって直ちに処理され、それぞれ API 20E および API 20NE を使用してエンテロバクテラル目およびその他の GNB を同定されました。

全ゲノム配列決定は、ガンビアの MRCG Genomics Facility で実施されました。 デオキシリボ核酸 (DNA) は、同定されたすべての GNB の培養物から抽出され、製造業者の指示に従って QIAamp DNA 抽出キット (Qiagen) を使用して単一細菌コロニーから増殖され、Illumina Miseq により 250 サイクルまで配列されました。 生のシーケンスリードの品質管理とトリミングは、それぞれ FastQC (v0.11.8) と Trimmomatic (v0.38) を使用して行われ、低品質の塩基とシーケンスアダプターを除去しました 33。 SPAdes (kmers: 21、33、55、および 77) を使用して全ゲノム de novo アセンブリを生成し、Quast34、35 を使用して品質をチェックしました。 500 コンティグを超えるすべてのドラフト アセンブリは下流解析から削除されました。 多座位配列タイピング (MLST) は、サンガー研究所の病原体グループ (https://github.com/sanger-pathogens/mlst_check) の mlst_check の get_sequence_type を使用して実行されました。 ゲノムには Prokka を使用してアノテーションが付けられ、コア ゲノムは Roary36,37 を使用して分析されました。 一塩基多型 (SNP) 距離を使用して、同じ種の分離株間の遺伝的距離を計算し、関連性を推測しました。 ABRicate を使用して、ARG-ANNOT データベースを使用して AMR 遺伝子保有率を決定し、最小カバレッジ 70% と同一性 75% を設定しました (https://github.com/tseemann/abricat)。 MEGARes データベースによると、遺伝子型 MDR は、3 つ以上の異なる抗菌クラスをコードする AMR 遺伝子の存在として定義されました 38。 MDR が存在するかどうかに関係なく、以前に記載された ESBL 遺伝子型が 1 つ以上同定された場合、分離株は最新の Bush-Jacoby 機能分類システムに従って ESBL 産生と定義されました 39,40,41。 最尤系統樹は、100 個のブートストラップを備えた RAxML を使用してアライメントされたコア SNP から生成され、iTOL で視覚化され、注釈が付けられました42、43。

分子処理およびバイオインフォマティクス分析の再現性に関する詳細は、メソッドの関連セクションで概説されています。 保菌率は、MDR および ESBL 状態、参加者の種類 (新生児/母親)、新生児のサンプリング部位 (皮膚/周縁) による層別化により、サンプリングされた参加者の総数のうち、遺伝子型が特定された細菌が定着した参加者の割合として計算されました。アナル）とサンプル採取の日。 参加者の特徴は、欠損データの完全なケース分析を伴うデータ分布に従って説明されました。 これは観察的なパイロット研究であったため、サンプルサイズは事前に計算されませんでした。

LSHTM 観察倫理委員会 (Ref. 11887) およびガンビア政府/MRCG 合同倫理委員会 (Ref. 1503) からの倫理承認を得て、関連するすべての倫理規制が遵守されました。 データ収集に先立ち、新生児の最初に入手可能な親族から書面によるインフォームド・コンセントが求められ、母親からのサンプリングについては別途同意が求められた。 提供されない場合はゲノム分析から除外することにより、サンプルに関する将来の研究について同意が求められました。 参加者はいつでも自由に研究から撤退することができました26。

この研究には、研究の設計、実施、解釈、著者作成に地元の研究者が参加しました。 この研究はガンビアに関連しており、地元のパートナーによって決定されています。 ゲノム活動に先立って、地元研究者（MK）の能力開発を組み込んだサンプル処理と分析の役割と責任が合意されました。 すべてのサンプルはガンビアで処理され、ガンビアのチームメンバーによってバイオインフォマティクス分析が行われました。 この原稿では、関連する地方および地域の研究結果が考慮され、適切に引用されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

スクリーニングされた新生児 89 人のうち、36 人が適格基準を満たし、34 人が 114 個の新生児馬車綿棒を採取してサンプリングを受けました (図 1)。 21人の母親がサンプリングされ、そのうち19人がサンプリングされた新生児と関係があった。 2 組の双子と母親のペアが存在するため、21 人の新生児と母親の二子関係が含まれました。 母体の RV サンプルの 76% は新生児入院後 24 時間以内に採取されました (表 1)。

a 採用されないその他の理由としては、研究用体重計で体重が 2 kg を超えていること (n = 2)、研究手順を実行できるスタッフがいない (n = 2) などが挙げられます。 b 新生児ペアの綿棒が存在しない状態で 2 人の母親がサンプリングされ、2 組の双子が含まれました。 c36 の新生児が登録されましたが、急速な悪化と死亡 (n = 1) および新生児サンプリングへの同意の欠如 (n = 1) により、2 人はサンプリングされませんでした。 d 参加者の 1 名は、肛門穴が開いていないため、肛門周囲サンプルの適格性を満たしていませんでした。 e 新生児 2 人は皮膚綿棒を採取されませんでした。1 人は除外基準を満たしました。 1 名は再サンプリングの同意を撤回されました。 f 再サンプリングの同意が撤回されたため、1 人の新生児は肛門周囲スワブを採取されませんでした。 g 1 人の新生児は、エラーにより皮膚または肛門周囲のサンプルを採取されませんでした。 GNB グラム陰性桿菌、WGS 全ゲノム配列決定。

入院時の新生児体重の中央値は 1,330 g (71% < 1.5 kg)、在胎週数の中央値は 33 週で、双生児は 18% (6/34) でした。 91% (32/34) は、研究施設で生まれた新生児 (出生児) と、出生後の移植を行った他の場所で生まれた新生児 (出生児) が組み合わされた医療施設で生まれました。 少なくとも 1 つの敗血症危険因子 (母子発熱、絨毛膜羊膜炎の疑い、または 18 時間以上の長期破水) が新生児の 13% (23 人中 3 人) に存在し、17% (23 人中 4 人) が分娩前 48 時間以内に抗生物質の投与を受けていました。 生後 28 日以内の入院患者の死亡率は 62% (21/34) で、死亡時年齢の中央値は 2.5 日でした (表 1)。 死因に関する信頼できるデータは入手できなかった。

135 個の新生児および母親の馬車スワブから、従来の細菌学から 137 個の GNB 分離株が得られ、112 個の高品質の de novo アセンブリが得られました (図 1)。

得られた112の高品質のde novoアセンブリのうち、70％（78/112）が新生児に由来し、30％（34/112）が母親に由来しました（補足図1a）。 最も頻繁に同定された種は、大腸菌 (40%、45/112) および肺炎桿菌 (33%、37/112) でした。 大腸菌分離株の半数（23/45）は母体の RV サンプルに由来しました。 特定された肺炎桿菌の76％（28/37）は新生児起源であり、主に肛門周囲サンプルからのものでした（補足図1a）。 すべてのGNB分離株のほぼ4分の3（73％、82/112）は、肺炎桿菌の76％（28/37）および大腸菌の73％（33/45）を含む遺伝子型MDRを示しました（補足図1b）。

NNU 入院時に、新生児の 41% (14/34) が 1 つ以上の MDR-GNB を保有し、32% (11/34) が 1 つ以上の ESBL 生成 GNB を保有していました。 MDR-GNB 保菌率は皮膚 (9/34、26%) と肛門周囲 (8/33、24%) に均等に分割され、3 人の新生児が両方の部位に MDR-GNB を定着させました (表 2)。 生存している新生児はすべて、1週間後に1つ以上のMDR-GNBを保有しており、入院時と比較して85％（11/13）が少なくとも1つの新たなMDR-GNBを保有していた（表2）。

新生児の 29% (10/34) は入院時に大腸菌が定着しており、主に皮膚 (21%、7/34) に感染しており、新生児の 18% (6/34) には MDR と ESBL の両方の大腸菌保菌が存在していました。新生児。 入院時に肺炎桿菌を保有していた新生児は比較的少なく(21%、7/34)、MDR または ESBL 肺炎桿菌が定着した新生児はわずか 3 人 (9%) でした。 入院の最初の週に、MDR と ESBL の両方の大腸菌と肺炎桿菌の保菌率が増加し、最も大きな増加が観察されたのは肺炎桿菌 (MDR と ESBL の両方で 9% ～ 54%) であり、程度は低いですが E .coli (MDR と ESBL の両方で 18% ～ 23%) (表 2)。 11人の新生児には、入院7日目後に採取されたサンプルから21個の分離株が同定され、そのほとんどが肺炎桿菌（57％、12/21分離株）であり、主に肛門周囲ぬぐい液から同定された（補足図1a）。

母親の 76% (16/21) が 1 以上の MDR-GNB を直腸膣内に保有しており、62% (13/21) が ESBL 産生病原体を持っていました。 大腸菌が最も多く確認され、母親の 76% (16/21) が MDR-E に感染していました。 大腸菌。 母親の 4 分の 1 (24%、5/21) が MDR-K の RV 保因者でした。 肺炎。

37 個の高品質の de novo K. pneumoniae アセンブリを入手しました。 18 の異なる配列タイプ (ST) が決定されました。 ST607 が主な ST (11%、4/37) であり、ST37、ST133、ST307 (それぞれ 8%、3/37) が続きました。 分離株の 19% (7/37) には ST が割り当てられませんでした。 新生児 7 人は異なる時点で複数の肺炎桿菌が分離されており、そのうち 4 人は異なる ST を有していた: N019 (分離株 3 株)、N020 (分離株 4 株)、N029 (分離株 3 株)、N040 (分離株 2 株)。 2 つ以上の異なる時点で遺伝的に同一の肺炎桿菌を保有していた新生児は 2 人のみでした。 1) 雌新生児は 20 日と 28 日に肺炎桿菌 ST502 を保有していました (N002; SNP 差 = 11)。 ２）男性新生児は、７日目と１４日目に肺炎桿菌ＳＴ６０７を保有していた（Ｎ０１２；ＳＮＰ距離＝０）。 1 組の双子は、8 日目 (N019、双子 1、肛門周囲) と 21 日目 (N020、双子 2、皮膚) に同じ肺炎桿菌 (ST37、SNP 距離 = 0) を保有していました。 この双子のペアは、14 日目 (N019) と 29 日目 (N020) に同一の肺炎桿菌 (ST476;SNP 距離 = 17) を肛門周囲に保菌していましたが、母親 (M009) では同定されませんでした。 さらに、新生児日の肛門周囲スワブ（N048）および母親の右室スワブ（M022）から分離された、同一の肺炎桿菌を有する新生児と母親のダイアドの例は1つだけでした（ST3476; SNP距離= 0）（図2a）。 ）。 これには、別の保健センターで経膣分娩後に入院した未熟児の女性が関与していました。 この新生児は生後 7 日以内に死亡したため、さらなるサンプルは入手できませんでした。

肺炎桿菌。 b 大腸菌。 SNP 距離は、Roary から得られたコアゲノム アライメントを使用して分離株の遺伝的関連性を決定するために使用されました。 配列タイプ (ST) は、mlst パッケージ https://github.com/tseemann/mlst を使用して決定されました。 SNP 距離は R にインポートされ、circlize パッケージを使用してサーカス プロットを生成しました。 サーカス プロットの上半分では、内側のセグメントは、分離株が新生児 (茶色) から採取されたか母親 (赤色) から採取されたかを示し、母親の研究 ID (MXX) とサンプリング日が外側にアンダースコア (_) で区切られてラベル付けされています。 ）。 青色のフォントで強調表示されたサンプル ID は、ST を持つ新生児と母親のペアです。 下半分は肺炎桿菌または大腸菌の ST 型を示します。 サーカスプロットの上半分と下半分を結ぶ接続線は、特定の分離株がどの ST に属するかを示します。

45 の高品質大腸菌ゲノムが得られ、21 の異なる ST が同定され、2 つの分離株 (4.4%) には ST が割り当てられませんでした。 ST10が最も一般的で(20%、9/45)、続いてST69、ST127、ST3580(8.8%、4/45)でした。 最も一般的な新生児由来の大腸菌株は ST10 および ST3580 (それぞれ 18%、4/22) でした。 3 人の新生児は、さまざまな時点で複数の大腸菌分離株を保有していました。 1) 体重 1500 g の雌単生子は、0 日目に皮膚と肛門周囲のスワブの両方に大腸菌を持っていました (ST58 および未割り当て ST; N014)。 2) 女性の双子は 0 日目 (PA) と 7 日目 (皮膚と PA) (SNP 距離 = 1 ～ 128; N019) に大腸菌 ST10 を保有し、14 日目 (PA) には大腸菌 ST127 が存在しました。 3) 7 日目から 21 日目の間に採取された皮膚および肛門周囲のサンプルに、ある男性の独身者から 4 つの同一の大腸菌 ST3580 株 (SNP 距離 = 0-3; N029) が検出され、21 日目には大腸菌 ST648 も存在していました (図2b)。 大腸菌 ST10 は、母親の RV サンプルで最も一般的に観察された分離株でした (24%、5/21)。 母親の 14% (3/21) が 1 個を超える大腸菌 ST を保有していました。 1 組の新生児と母親のペアのみが同一の大腸菌保菌 (ST131; SNP 距離 = 0) を持ち、d0 の新生児肛門周囲保菌 (N048) と入院後 24 時間以内に採取された母親の RV サンプル (N022) を持ちました。 上述したように、この母親と新生児のペアも同一の肺炎桿菌株を持っていました。

合計 1131 個の AMR 遺伝子が 112 の分離株から同定され、111 の異なる遺伝子タイプを表し、10 種類の抗生物質に対する耐性をコードしていました。 ベータラクタム耐性が最も一般的であり（43%、48/111）、次にアミノグリコシドに対する耐性（18%、20/111）でした（図3、補足データ1）。 すべての肺炎桿菌および大腸菌分離株は 2 つ以上の AMR 遺伝子を有し、両細菌の分離株あたりの AMR 遺伝子の中央値は 11 でした (肺炎桿菌範囲 (3-19))。 大腸菌の範囲 (5 ～ 15)。 ESBL 遺伝子は、すべての GNB 分離株の 59% (66/112) に存在しました (補足図 1c)。

肺炎桿菌。 b 大腸菌。 最尤系統樹は、100 個のブートストラップを備えた RAxML を使用して、コアゲノム SNP から構築されました。 どちらの種でも、分離株は ST によってクラスター化されます。 抗菌剤耐性遺伝子 (AMR) の存在 (黒塗りの四角) または不在 (白抜きの四角) も示されています。

K. pneumoniae 分離株は合計 446 個の AMR 遺伝子 (51 の異なる遺伝子タイプ) を有し、10 種類の抗生物質、最も一般的にはベータラクタマーゼ (35.9%、160/446) に対する耐性をコードしていました。 19 の異なるベータラクタマーゼ遺伝子が同定され、最も一般的には BlaAmpH (97%、36/37 分離株) および BlaPBP (94%、35/37 分離株) でした。 少なくとも 1 つの ESBL 遺伝子が、肺炎桿菌分離株の 70% (26/37) と MDR-K の 89% (25/28) に存在しました。 肺炎、最も頻繁にCTX-M-15 (20/37、54%)およびBla-TEM-105 (18/37、49%) (図3、補足データ1)。 アミノグリコシド耐性は分離株の73％（27/37）に存在し、AGlyStrB（21/37、57％）、AGlyStrA（20/37、54％）、AGlyAac3-IIa（18/37、49％）が最も多かった（補足）データ1)。

大腸菌分離株は 456 個の AMR 遺伝子 (32 の異なる遺伝子タイプ) を保有し、8 つの異なる抗生物質クラス、最も一般的にはベータラクタマーゼ (44.1%、201/456) に対する耐性をコードしていました。 8 種類のベータ-ラクタマーゼ遺伝子が存在し、BlaAmpH、BlaPBP、BlaAmpC2 がすべての分離株に含まれ、BlaAmpC1 が 78% (35/45) 含まれていました。 大腸菌分離株の3分の2以上（69％、31/45）がESBL遺伝子を保有しており（補足図1c）、ほとんどがBla-TEM-105（53％、24/45）でした（図3、補足データ） 1)。 アミノグリコシド耐性は大腸菌分離株の 73% (33/45) に存在し、主に AGlyStA (31/45、69%) によるものでした (補足データ 1)。

主要なカルバペネマーゼ耐性遺伝子 (VIM 型、IMP 型、および NDM 型メタロベータラクタマーゼ、KPC または OXA-48) はいずれの GNB でも同定されませんでした。 しかし、A. baumannii 分離株の 91% (10/11) は、カルバペネマーゼ活性を持つクラス B3 β-ラクタマーゼである blaMbl を保有していました (図 3、補足データ 1)。

私たちが観察した入院患者の新生児 MDR-GNB 獲得率の高さ (85%) は、ヨーロッパの流行状況 (ノルウェーの 24%44)、モロッコ (58%)21 やマレーシア (22% と 52%) などの中所得国の NNU よりも高いです。 45. ESBL-GNBの割合はアフリカ地域内で大きく異なりますが、我々の所見はエチオピア（入院48時間後のESBL-GNB有病率74％）46やガーナなどの他の西アフリカ諸国（65％）47の表現型データに匹敵します。東アフリカからの統合有病率における大きな不均一性 (12 ～ 89%) が示すように、病院も同様である48。 私たちの先天性新生児と出生児の混合コホートでは、NNU 入院時に MDR-GNB 保菌率が高く (41%)、正確な時期や発生源についてはコメントできないものの、急速な定着が入院前期間に起こることを示唆しています。取得の。 入院7日後に我々が観察した54%のMDR肺炎桿菌保菌率は、入院中央値3日時点で新生児の49.6%が表現型MDR肺炎桿菌を有し、75.6%がESBL活性を示したガーナの高等NNUから報告されたものと類似している18。 入院時と 7 日後の保菌率の高さは、WASH リソースの利用可能性と最適な手指衛生、滅菌技術の提供、過密状態と人員不足 49、次善の感染予防管理システムと再感染など、さまざまな医療システム要因を反映していると考えられます。 - 使い捨ての消耗品および器具の使用。 これらすべての要因は、他のアフリカの NNU での MDR-GNB の発生に関連しており 20、このサイトでも以前に観察されました 22。

MLST は、21 の異なる大腸菌配列タイプ (最も多いのは ST10、ST69、ST127 および ST3580) と 18 の K. pneumoniae 株 (最も多いのは ST607、ST37、ST133、ST307) による実質的な種内の多様性を特定しました。 大腸菌株は、無害な共生菌から侵襲性感染に関連する病原性変異株まで多岐にわたります 50。そして私たちのコホートに定着するいくつかの株は、アフリカとアジアにおける新生児感染症と関連性があります (ST10、ST69) 50。 大腸菌 ST131 は毒性の高い菌株であり、新生児の主要な病原性変異株である 50 が、我々のコホートでは新生児とペアの母親が 1 人だけ保有していました。 この保菌率の低さは、新生児を含む 400 人以上の小児から分離された大腸菌の 4% から ST131 が同定されたギニアビサウの地域研究と一致しています 51。 ダイアド内の ST131 大腸菌株は同一であり、母親から新生児への感染が起こったことを示唆しており、これは大腸菌 131 がより優勢な保菌株である環境に関連している可能性があります。

我々が最も頻繁に同定した肺炎桿菌株のうち 2 つ（ST37、ST307）は侵襲性新生児感染症に関連しており、これまでにエチオピア（ST37）、ルワンダ（ST307）、ナイジェリア（ST307）から報告されています50。 我々は、サンプリング期間の 1 年前の現場での同時発生に関与していた肺炎桿菌 ST39 または ST31535 (K. quasipneumoniae) を特定しませんでした 22。これは、以前の発生が封じ込められたことを示唆しています。 株特異的な新生児大腸菌および肺炎桿菌の保菌を記述している他のアフリカのゲノムデータは限られており、これは優先研究分野である。

ベータラクタマーゼは、同定された最も一般的な AMR 遺伝子であり、AmpH、ペニシリン結合タンパク質 (PBP)、TEM、および CTX-M 遺伝子タイプが優勢で、ゲンタマイシンとともに WHO が推奨しているアンピシリンおよび第 3 世代セファロスポリンに対する耐性を与えています。新生児敗血症に対する第一選択および第二選択の抗生物質。 私たちの分離株におけるカルバペネム耐性遺伝子の蔓延の低さは、ケニア (14%)52、ガーナ (15.6%)53、タイ (64%)54 から報告されたより高いレベルとは対照的であり、おそらく私たちの環境で入手可能なカルバペネム抗生物質が限られていることを反映しており、したがって、選択圧が減少します。 しかし、A. baumannii における blaMbl のほぼ遍在的な存在は、可動性の遺伝要素による種間伝達のリスクにより懸念されています 55。 これは、抗菌薬の管理と AMR 監視の指針として、ガンビアおよび西アフリカの他の地域における将来のゲノム監視の優先度が高い分野です。

母親の MDR-GNB 保因率の高さ (76%) は、他のいくつかのアフリカの研究と一致しているが 24、ケニアでの同様の新生児と母親の二者関係の研究 (15%) よりも著しく高く 52、ヨーロッパ (フランス) で観察されたより低い有病率とは対照的である。 、12.8%;)24および中東(レバノン、19.1%)。 母体サンプルは、さまざまな医療施設での出産後、NNU 入院後 72 時間以内に採取されたため、地域での広範な蔓延や分娩中の医療施設関連の獲得を反映している可能性のある母体の搬送源を推測することはできません。 アフリカのコミュニティにおける ESBL-GNB の蔓延は広範囲に及んでおり、外来の横断研究では、ギニアビサウの小児の保菌率 32.6% 51、マダガスカルの小児の保菌率 21.1% 56、エジプトの成人と小児の保菌率 63.3% が示されています 57。 母親のGNB獲得は入院に一時的に関連しており、スリランカではRV保菌率が出産前の18.8%から産後病棟退院時の41.5%に増加していることも報告されている58。

重要な発見は、我々の新生児コホートは、ペアの母親の RV サンプルと比較して、皮膚と腸に遺伝的に異なる MDR-GNB 分離株を保有していたということです。 母親と新生児の保菌率が高いにもかかわらず、同一の大腸菌株と肺炎桿菌株を持つ新生児と母親のペアは 1 組だけ特定されました。 これは、この部位では、周産期および出生後早期の新生児の MDR-GNB 獲得において母親が重要な役割を果たしていないことを示唆しています。 これは、新生児定着の推定 19%（5 件の研究からプール）が定着した母親からの感染に関連しており、母親の MDR-GNB 保菌が新生児獲得の危険因子であることを示す HIC および MIC の証拠とは対照的である 24。 しかし、LIC環境、特にアフリカにおける母親から新生児へのMDR-GNB感染を調査したしっかりとしたゲノム研究は不足しており24、新生児のMDR-GNB感染は複雑であり、複数の状況特有の影響を受けるため、他の環境からの所見を外挿することは避けるべきである。医療システムの要因11. 臨床的早期発症敗血症を患うガンビア新生児の横断研究では、母親の生殖管定着からの垂直感染の有病率は低く、黄色ブドウ球菌の感染リスクはわずか14%であり、母親と新生児のペアからは遺伝子型に関連するGNB分離株は存在しないことが報告された25。 南アフリカでのコホート研究では、母体由来と新生児由来の ESBL 産生 Enterobacter cloacae の間のクローン関連性が同様に低い例 (1.1%) で報告されました 59。 スリランカのペアコホート研究では、ESBL を産生する Enterobacterales の母体移植率が 0.6% であると報告されています 58。 マダガスカルの同様の資源の少ないNNUで実施された詳細なゲノム感染研究でも、母親を含む家族が感染に関与していないと報告されている60。

我々は、大腸菌および肺炎桿菌のクローン伝播は確認されておらず、複数の感染源が示唆されています。 NNU の環境汚染はよく知られており、MDR-GNB は手に付着しても長期間生存できる 20、胃栄養チューブなどの医療製品 61、吸引器 62、水道、シンク、無生物の表面 18,63 に付着しても生存することができます。 この研究の前年に我々の研究施設で、バークホルデリア・セパシアとESBL-Kによる風土性および流行性MDR-GNBの発生が発生した。 侵襲性分離株と遺伝子型の連鎖がある点滴液調製物および抗生物質バイアルから分離された肺炎 22。 私たちの研究中に環境サンプルは収集されなかったため、環境取得の正確な情報源についてコメントすることはできません。 しかし、母親から新生児への感染、MDR-K の広範な保菌に関する証拠はありません。 7 日目の肺炎と同定された株の不均一な多様性は、複数の環境源を強く示唆しています。 このことは、将来の研究によって確認されるべきであり、理想的には分娩中および生後早期に母親と新生児が管理される一連の施設（出産場所、紹介施設、および三次NNUを含む）からの環境監視との連携によるものであることが確認されるべきである。

この研究の限界には、単一の細菌コロニーの配列決定が含まれており、腸内に運ばれるGNB64の広範な宿主内多様性を捕捉できていない可能性があります。 サンプルは乾季の短期間に収集され、細菌感染と保菌に関するガンビアの他の研究で示されているように、MDR-GNB 保菌率は季節によって異なる可能性があります 65。 死亡率が高いため、サンプルは14日以降に制限されました。 したがって、7 日を超えた MDR-GNB 保菌の持続または解消、あるいは母体保菌の取得のタイミングについてコメントすることはできません。 私たちの調査結果は、同様にリソースの少ない病院環境に一般化可能であり、病院ケアと環境細菌負荷の文脈の違いにより、比較できない環境に当てはめるべきではありません。

私たちの発見を確認するには、サンプルサイズを大きくし、正確な感染時期、MDR-GNB 保菌の危険因子、侵襲性感染症との関連性の解明など、臨床転帰との関連性を伴うさらなる研究が必要である。 我々の発見は、複数の環境源が新生児のMDR-GNB伝播に重要な役割を果たしていることを示唆しており、出産場所からNNUまでの新生児の移動過程の各時点での保有源を描写し特定するための、さらなる的を絞った研究が正当化される。 これらの重要な新生児病原体の循環を遮断する介入を特定するには、地域社会と病院の両方で母親による MDR-GNB 保菌の獲得を調査することも必要です。

ガンビアで入院している小さな脆弱な新生児は、MDR-およびESBL-GNBの保菌率が高く、出生から入院7日目までに感染します。 母親の MDR-GNB 保菌率が高いにもかかわらず、母親から新生児への感染を裏付ける証拠は限られたものしか特定されませんでした。 大腸菌株と肺炎桿菌株の不均一な多様性と広範な AMR 遺伝子の存在は、分娩部位から新生児ユニットまでの複数の環境源を示しています。 さまざまな資源の乏しい環境における感染経路を完全に理解し、最も脆弱な新生児に対する標的を絞った感染予防制御介入の開発に情報を提供するには、新生児および母体の MDR-GNB 感染に関するより包括的なゲノム研究が必要である。

この研究で使用したゲノム データセットは、Sequence Read Archive (アクセッション番号 PRJNA73082) からアクセスできます。 患者の機密保持上の理由から、リンクされた臨床メタデータへのアクセスは、データ共有に関する治験審査委員会の要件に沿って、責任著者への合理的な要求に従って利用可能になります。

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著者らは、LSHTM ガンビア MRC ユニットの次の人物に感謝します: Yusupha Njie、Binta Saidy、および Bai Lamin Dondeh (データ管理)。 アルファ・ジャロウ、ニジラン・ジョンソン、マリー・ローズ・ソープ、エリザベス・バッチリー（研究支援）。 Demba Sanneh 氏と Mathurin Diatta (バイオバンク) 氏に加え、研究室の貢献と支援に対して Buntung Ceesay 氏、Mamadou Jallow 氏、Dawda Cham 氏に感謝します。 さらに、データ収集を促進していただいたガンビア政府保健医療省エドワード・フランシス小規模教育病院の諮問委員会に感謝いたします。 最後に、この研究に寛大にご参加いただいた新生児とその母親に感謝いたします。 Wellcome Trust (Ref.200116/Z/15/Z) は、HB へのフェローシップ資金の一環として、サンプルの収集と微生物学的分析に資金を提供しました。 グランド チャレンジ探査助成金 (Ref.OPP1211818) はゲノム解析に資金を提供しました。 資金提供者は、研究の計画、実施、分析、またはこの原稿の執筆において何の役割も果たしませんでした。

これらの著者は同様に貢献しました：Saikou Y. Bah、Mariama A. Kujabi。

フローリー宿主病原体相互作用研究所、シェフィールド大学感染・免疫・心血管疾患学部、シェフィールド、英国

西光 Y. バー & トゥシャン I. デ シルバ

MRC ユニット、ガンビア、LSHTM、アトランティック ロード、ファハラ、ガンビア

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ロンドン衛生熱帯医学大学院疫学・人口保健学部感染症疫学学科、ロンドン、英国

ジョイ・E・ローン & ヘレン・ブラザートン

ロンドン衛生熱帯医学大学院感染症・熱帯病学部臨床研究部、ロンドン、英国

ベアテ・カンプマン

国際保健研究所および国際保健センター、Charite Universitätsmedizin、ベルリン、ドイツ

ベアテ・カンプマン

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HB および T.dS。 JEL と BK からの意見をもとに研究を概念化し、資金を獲得しました。 データとサンプルの収集は、HB と JEL の監督のもと、BFKK と RB によって実施されました。 NK、MAK、SDは微生物処理を行った。 MAK は、AK、Td.S からの情報提供を受けて、すべての DNA 抽出および配列決定手順を実施しました。 そしてAKS。 SYB は、系統樹の生成や MLST 分析を含むすべてのバイオインフォマティクス分析を実行しました。 SYB、MAK、HB が原稿を作成し、SD と Td.S. からの意見をもとに図を作成しました。 著者全員が論文の全体的な方向性と内容に意見を提供し、最終版を確認して承認しました。 SYB と MAK はこの作業に等しく貢献しました。

ヘレン・ブラザートンへの手紙。

著者らは、次の競合する利益を宣言しています。BK は、英国の MRC UK Research & Innovation (UKRI) からの助成金を報告しています。 英国のウェルカム トラストと米国のビル アンド メリンダ ゲイツ財団 (BMGF) は、ワクチンと妊産婦/新生児の健康に関連するさまざまなプロジェクトに貢献しています。 BKは、BMGFの支援を受けて2022年のゲイツ・グローバル・チャレンジ・ミーティングに出席し、新型コロナウイルスワクチン製造会社のデータ安全性監視委員会のメンバーでもあります。 Td.S. は、Communications Medicine の編集委員ですが、編集レビューや査読、あるいはこの記事の出版の決定には関与していません。 他の著者には競合する利益はありません。

Communications Medicine は、この研究の査読に貢献してくれた Adam Irwin と他の匿名の査読者に感謝します。 査読ファイルが利用可能です

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転載と許可

Bah、SY、Kujabi、MA、Darboe、S. 他ガンビアの入院新生児における遺伝的に多様な多剤耐性グラム陰性桿菌の獲得と保有。 Commun Med 3、79 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s43856-023-00309-6

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受信日: 2022 年 12 月 5 日

受理日: 2023 年 5 月 25 日

公開日: 2023 年 6 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s43856-023-00309-6

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