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Sep 29, 2023

食品腐敗および食品由来の病原菌に対する土壌からのバクテリオファージの分離と特性評価

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9282 (2023) この記事を引用

40 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

微生物による食品の腐敗と食中毒は、食品業界における食品の保存期間に関する主な課題です。 現在の保存方法では、感覚特性の変化や栄養素の損失が頻繁に発生します。 このため、バクテリオファージは、感覚特性を変えることなく食品中の細菌汚染を減らすことができる生物防除剤として、代替の自然な方法を提供します。 この研究は、セレウス桿菌や枯草菌などの食品腐敗菌や、腸毒素原性大腸菌（ETEC）や腸管出血性大腸菌（EHEC）などの食品由来の病原菌を制御するために土壌からバクテリオファージを単離し、特徴づけるために実施されました。 寒天重層法により単離し、ファージBC-S1、BS-S2、ETEC-S3、EHEC-S4を回収した。 単離されたすべてのファージの宿主範囲は狭い傾向があり、特定の細菌に対して高い特異性を持っていました。 ETEC-S3がB.セレウスに対して効果を示さず、EHEC-S4が腸管病原性大腸菌（EPEC）に対して低い効率を示した場合のファージ効率を測定した。 透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いてファージ BC-S1 および ETEC-S3 の形態解析を行ったところ、ファージがカウドウイルス目に属することが示されました。 ファージ BC-S1 および BS-S2 は、miMOI 0.1 で米飯および低温殺菌牛乳のサンプルに適用すると、宿主細菌を大幅に減少させました。 一方、miMOI 0.001 のファージ ETEC-S3 および miMOI 1 のファージ EHEC-S4 も、保存温度 4 °C および 28 °C で鶏肉およびレタスのサンプルに適用すると、大幅な減少を示しました。 28 °C でのインキュベーションで、低温殺菌乳サンプルに対するファージ BC-S1 によって 100% という最高の細菌減少が示され、鶏肉サンプルに対するファージ ETEC-S3 によって最大 96.06% の減少が示されました。

食品の微生物による汚染は、食品業界における大きな懸念事項です。 汚染された食品には、食品をエネルギー源として利用する細菌など、さまざまな微生物が含まれている可能性があり、食品の腐敗や食中毒を引き起こすことはありません1。 食品の腐敗は、製品の感覚特性に何らかの変化をもたらし、食品が消費に望ましくないものとなる可能性があります。 異臭、異味、色、食感の変化を引き起こすさまざまな代謝副産物は、食品ロスにつながる可能性があり、多大な経済的および環境的影響を引き起こします2。 バチルス属 Bacillus cereus や Bacillus subtilis などのグループは、胞子を形成する細菌であり、その胞子は高い処理温度でも生き残ることができます。 パンのパサパサ感、米の粘液形成、牛乳の異臭など、多くの腐った食品によく見られます3,4。 腐った食品は食べても安全かもしれませんが、一部の細菌は食中毒を引き起こす病原性を持っている可能性があります。 死に至ることもある下痢性疾患に関与する主な病原体の 1 つは、ETEC や EHEC5 など、土壌や水中に存在する下痢原性大腸菌 (DEC) です。

食品の細菌汚染に関連する多くの危険因子は、多くの場合、その加工、準備、保管、取り扱い方法に関連しています。 食品の安全性を向上させるために、低温殺菌、高圧処理、放射線照射、化学薬品や生物薬剤などの従来の食品保存方法が一般的に使用されています。 しかし、これらの治療法は、感覚特性の変化、栄養素の損失、毒性を脅かす副作用を伴うことがよくあります6,7。 さらに、さまざまな方法が利用可能であるにもかかわらず、食中毒の発生は依然として比較的頻繁に発生しています8。 このため、食品の腐敗を制御する代替の保存方法を見つけることが必要です。

いくつかの欠点に対処する有望で安全な技術の 1 つは、バクテリオファージの生物的制御です。 この方法では、食品の安全性を高めるために、溶解性バクテリオファージを使用して病原性細菌を特異的に標的にし、食品中の細菌のレベルを排除または大幅に低減します。 バクテリオファージは、生きた細菌宿主を溶解するウイルスです。 この溶解能は、食品生産のさまざまな段階で細菌を制御するための、より自然な抗菌アプローチを設計する試みに利用されてきました9。 これらは宿主特異性が高く、安全に摂取でき、比較的安価で、食品の官能特性を変化させません10。 それらは土壌など、生きた細菌が存在する場所のほぼどこでも見つけることができ、治療目的で細菌を分離する可能性を提供します。 したがって、代替の自然保存としてのバクテリオファージの使用は非常に有望です6,11。 これらの背景に基づいて、この研究は、食品腐敗および食中毒菌（B. cereus、B. subtilis、ETEC、EHEC など）の制御において土壌からバクテリオファージを分離し、特徴づけることを目的としました。

Bacillus cereus ファージ S1 (BC-S1)、Bacillus subtilis ファージ S2 (BS-S2)、ETEC ファージ S3 (ETEC-S3)、および EHEC ファージ S4 (EHEC-S4) が、有機廃棄物処分場近くのさまざまな土壌サンプルから分離されました。 寒天オーバーレイアッセイの結果として形成された透明なプラークは、ファージによる細菌の溶解を示した。 単離されたバクテリオファージの濃度は、力価測定によって測定されました。 ファージ BC-S1 は、1.72 ± 0.31 × 1010 PFU/mL の値で最も高い力価を示しました。これに比べて、ファージ BS-S2 は 1.57 ± 0.92 × 109 PFU/mL、ファージ ETEC-S3 は 8.24 ± 1.38 × 109 PFU/mL、またファージ EHEC-S4 の値は 1.26 ± 0.86 × 105 PFU/mL です。

分離されたバクテリオファージの宿主範囲は、B. cereus、B. subtilis、ETEC、EHEC、EPEC、および Vibrio cholerae を使用して決定されました。 単離されたバクテリオファージの宿主範囲を表 1 に示します。宿主細胞を溶解する能力に加えて、ファージ ETEC-S3 は B. セレウスに対して溶解活性を示し、ファージ EHEC-S4 は EPEC に対して溶解活性を示しました。 一方、ファージ BC-S1 とファージ BS-S2 は、宿主自体を溶解することしかできないことを示しました。 それらは、同じ属に属する他の細菌であっても攻撃できない高い宿主特異性を示しました。

単離されたファージはすべて、特定の細菌、つまりその細菌宿主に感染する場合にのみ活性を示しました。 しかし、ファージETEC-S3は、EOPが0.001未満でB.セレウスを非効率的に攻撃することも判明したが、ファージEHEC-S4もEPECに対してEOPが0.001〜0.2と低効率であった（表2）。

バクテリオファージ MOI は、102 から 10-5 までの 8 つの異なる濃度で実行されました。 ポジティブコントロールはバクテリオファージを加えず宿主細菌のみを示し、ネガティブコントロールは宿主細菌を加えずバクテリオファージのみを示しました。 その結果、MOI 0.1の場合、ファージBC-S1(図1)およびファージBS-S2(図2)に対して最も高い阻害が示された。 一方、ETEC-S3、MOI 0.01 から最高 MOI 100 までは、インキュベーションの最初の 6 時間は増殖せずに ETEC を阻害し、その後 ETEC が再増殖します。 したがって、ファージ ETEC-S3 の miMOI は 0.001 でしたが、グラフでは ETEC の細菌増殖は示されませんでした (図 3)。 ファージEHEC-S4のmiMOIは1であり、これはインキュベーション10時間以内にEHECの増殖を阻害することができた。 MOIが増加するにつれて細菌の増殖は減少しました（図4）。

バクテリオファージ BC-S1 の miMOI。

バクテリオファージ BS-S2 の miMOI。

バクテリオファージ ETEC-S3 の miMOI。

バクテリオファージ EHEC-S4 の miMOI。

図 5 に示すように、バクテリオファージ BC-S1 およびファージ ETEC-S3 は、透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用した高い活性のため、形態決定を継続しました。ファージ BC-S1 は、直径約 75 nm および約 90 nm の正二十面体頭部を形成しました。収縮性の尾。 一方、ファージ ETEC-S3 は、直径約 65 nm の正二十面体頭部と約 100 nm の収縮尾部を形成しました。

TEM によるバクテリオファージの形態 (a、BC-S1; b、ETEC-S3)。

各バクテリオファージは、食品サンプル上の特定の病原性細菌の数を減らす能力についてテストされました。 ファージ BC-S1 と BS-S2 を米飯と低温殺菌牛乳に適用し、ファージ ETEC-S3 と EHEC-S4 を鶏肉とレタスに適用して、さまざまな食品マトリックスと表面に対する適用の効果を調べました。 インキュベーションは、冷蔵保存温度 (4 °C) および室温 (28 °C) で一晩実行されました。 結果を表 3 に示します。表 3 では、すべての単離されたバクテリオファージがすべてのサンプルおよび処理で減少を示しました。 ファージ BC-S1 および BS-S2 による最も高い減少率は低温殺菌牛乳サンプルで見られましたが、ファージ ETEC-S3 および EHEC-S4 は保存温度 28 °C の鶏肉サンプルで最も高い減少率を示しました。

バクテリオファージは地球上で最も豊富な生命体であり、土壌、水、食物など、ほぼすべての生息地で見つけることができます。 有機廃棄物処分場の近くの土壌は、多数の多様な細菌を含むため、バクテリオファージを分離するのに理想的な供給源であるため、サンプルとして使用されました。 したがって、そのバクテリオファージが存在する可能性があります。 農地土壌 1 グラムあたり、推定 1.5 × 108 個のバクテリオファージが存在します12。

4 つのバクテリオファージ、すなわち B. セレウスに対するファージ BC-S1、枯草菌に対するファージ BS-S2、ETEC に対するファージ ETEC-S3、および EHEC に対するファージ EHEC-S4 の回収に成功しました。 これらのファージは、寒天オーバーレイアッセイにおける明確なプラーク形成のため、溶解性バクテリオファージと考えることができます。 しかし、バクテリオファージが存在しない領域では、細菌は定常期まで増殖し、軟寒天オーバーレイ内にコンフルエントな不透明な層または「芝生」を形成します13。 バクテリオファージを生物的防除剤として適用するために必要な基準には、安全性を確保するために必ず溶解性、非形質導入性、および毒素遺伝子が含まれていないことが挙げられます14。 溶解性バクテリオファージは、宿主細胞に付着し、核酸を注入し、溶解することによって複製し、ファージの子孫を生成します。 その後、「生まれたばかりの」バクテリオファージは、別の細菌細胞に感染して次のサイクルを開始する準備が整います。 溶原性サイクル中、ファージはその核酸を宿主細胞の染色体に組み込み、細胞を破壊することなくユニットとして複製します15。 したがって、バクテリオファージは、その毒性を増大させる可能性がある毒素遺伝子導入の効力を低下させるために、絶対的に溶解する必要がある16。

単離されたバクテリオファージの濃度を知ることが不可欠です。 バクテリオファージの力価は、ファージ療法の応用における有効性に影響を与える可能性がある要因の 1 つです。 高い力価値は、ファージの安定性が良好であることを示します。 バクテリオファージの治療用途への応用には、高力価の溶解性ファージ (109 PFU/mL) が必要です17。 この研究では、単離されたバクテリオファージの力価は 105 ～ 1010 PFU/mL の範囲で変化しました。 長期間保存すると力価が低下する可能性があるため、ファージの安定性を高力価で維持するために定期的にバクテリオファージをリフレッシュすることが推奨されます 18。

宿主範囲決定によるバクテリオファージの特性評価も、宿主細菌のさまざまな菌株に対する単離されたファージの能力を評価する際の 1 つの要素です。 ファージ ETEC-S3 は B. セレウスに感染する能力があることが判明し、ファージ EHEC-S4 は EPEC に感染することができますが、どちらも効率が低かったです。 単離されたバクテリオファージはすべて、ファージ BC-S1 または BS-S2 を含む、高度に特異的または狭い宿主範囲に対して実行されました。これは、バクテリオファージが細菌宿主に対してのみ高い溶解活性を示したのに対し、いくつかの病原性細菌に対しては効力が低く、宿主に対して溶解活性を示さなかったためです。その他、さらに。 一般に、新たに単離されたバクテリオファージは、単離された宿主と同じ一般的な受容体タイプを持つ宿主にのみ感染できます14。 細胞受容体の位置はファージや宿主によって異なります。 それは、細菌細胞の細胞壁、鞭毛、線毛、莢膜、または表面タンパク質に存在する可能性があります。 受容体がアクセスできないか、ファージ受容体結合タンパク質に相補的でない場合、ファージは宿主細胞に結合できません19。 他の研究では、単一の宿主株の細菌を使用して単離されたほぼすべてのバクテリオファージは、広い宿主範囲ではなく狭い宿主範囲を持つ可能性が高い可能性があることを示唆しています。 多くの場合、この狭い特性は通常、宿主自体に対して優れた特異性を持ち、他の種の細菌の死滅を防ぎ、細菌宿主の残りの部分を無傷のまま残すため、望ましいものです。 この狭い宿主範囲のファージは、ファージ治療の宿主範囲を広げるファージカクテルの開発にも不可欠です。 この場合、カクテルの個々のファージの特性評価が必要です14,20。

メッキ効率 (EOP) を使用して、標的細菌に対するバクテリオファージの有効性を定義しました。 0.5 ～ 1.0 の EOP 値は高効率としてランク付けされ、0.2 ～ 0.5 の EOP 値は中効率として分類され、0.001 ～ 0.2 の EOP 値は低効率として分類され、0.001 未満の EOP は非効率です21。 結果によると、ファージ EHEC-S4 はファージ ETEC-S3 よりも高い効率を実行しました。 ファージ ETEC-S3 は B. セレウスに対して効果がないと考えられていましたが、ファージ EHEC-S4 は EPEC に対して低い効率を示しました。 単離された両方のファージは、細菌宿主に対してのみ高い活性を示したため、高い特異性を示しました。 EOP の低下は、細胞内ウイルスの発生をブロックする宿主抵抗システムの作用、または宿主細胞へのバクテリオファージの吸着不良によって引き起こされる可能性があります 22。

MOI は PFU/CFU 比として決定され、細菌に付着して感染した吸着ファージのみをカウントします 23。 使用できる潜在的な有効濃度を決定するには、最小 MOI 値を調べる必要があります。 この研究では、単離されたすべてのファージは、各宿主を完全に阻害または溶解するために異なる最適 MOI を示しました。 ファージ BC-S1 および BS-S2 で得られた最小 MOI 値は 0.1、ファージ ETEC-S3 の MOI は 0.001、ファージ EHEC-S4 の MOI は 1 でした。ファージ ETEC-S3 は他と比較して最も低い MOI を示しました。これは、細菌の数を減らすにはより低いファージ濃度が必要であるため、ファージ ETEC-S3 がより効果的であると考えられることを示しています。 実効 MOI 値は、感染するファージの数、付着する標的細胞の数、付着に許容される速度と時間などの環境条件に影響されます 12,23。 ファージ BC-S1、BS-S2、および EHEC-S4 は、より高い MOI 数値を使用した場合、溶解活性においてより良い結果をもたらしました。 MOI の使用量が増加するとファージ粒子が宿主細菌に感染する可能性が高まるため、MOI が増加するにつれて細菌の増殖は減少しました。 MOI 値が低くても、細菌宿主の増殖を完全に阻害することはできませんでしたが、依然として減少が示されました。 バクテリオファージの濃度が高いほど、より多くの細胞が溶解され、迅速な溶解活性が得られることを意味します24。 しかし、これらのファージはファージ ETEC-S3 とは異なり、MOI が 0.001 を超えても細胞の増殖を完全に阻害できませんでした。 最初の 6 時間の培養で細菌の減少が見られ、その後細菌は再び増殖し続けました。 MOI の点でファージ濃度が高すぎると、ファージが受容体に結合すると、新しいビリオンが細胞にアクセスすることなく、ファージ溶解素の酵素作用によって細菌の溶解が起こる可能性があります。 したがって、バクテリオファージの増殖的感染が停止し、残りの病原体集団に侵入するウイルスが生成されなくなります25。

バクテリオファージの分類は、その核酸の種類と形態によって異なります。 バクテリオファージは頭部と尾部で構成されています。 ヘッドまたはカプシドは、遺伝物質を二十面体の形で包み込むタンパク質の殻です。 尾部には通常、サイズが異なる6本の尾部繊維があり、特定の宿主細胞に付着するために細菌の細胞壁表面の付着部位を認識するタンパク質受容体を保持しています26、27。 尾のあるバクテリオファージ (カウドウイルス目) は、尾の形状 (ICTV) に基づいて 4 つのファミリーに分類されます。 ミオウイルス科は、長さ 80 ～ 485 nm の長くて硬くて収縮性のある尾を持ち、平均頭部直径は 85 nm です。 シフォウイルス科は、長さ 79 ～ 535 nm、平均頭部直径 55 nm の非収縮性の長くて柔軟な尾を持っています。 ポドウイルス科は、長さ 40 nm 以下の非収縮性の短い尾と、平均頭部直径 58 nm を持っています。 また、新たに作成されたアッカーマンウイルス科は、最大 4 つの尾部スパイクタンパク質を持ち、広範囲のグラム陰性菌に感染することができます 29。 この研究では、単離されたバクテリオファージ BC-S1 および ETEC-S3 の形態を TEM を使用して分析しました。 結果に基づいて、両方のファージは、収縮性尾部に取り付けられた正二十面体の頭部を示しました。 両方のファージがカドウイルス目のメンバーに属していると想定できます。 分類を具体的に知り、これらのファージに病原性関連遺伝子や抗生物質耐性遺伝子が含まれていないことを確認するには、さらなる研究のためにバクテリオファージのゲノムの分子分析が必要です30。

バクテリオファージは細菌の死を引き起こすため、食品保存料としての使用の可能性がますます魅力的になっています。 この研究では、バクテリオファージ BC-S1 と BS-S2 を米飯と低温殺菌牛乳に適用してセレウス菌と枯草菌の増殖を制御し、バクテリオファージ ETEC-S3 と EHEC-S4 を鶏肉と新鮮なレタスに適用して制御しました。 ETEC と EHEC の成長。 単離されたすべてのファージは、すべての保存温度において、すべてのサンプル中の宿主細菌数を大幅に減少させることができました。 室温および低温保管が選択されたのは、食品や飲料の短期間の保管には通常一般的な温度が使用されるためです。

全体として、低温殺菌牛乳サンプルの細菌減少率は米飯よりも高く、鶏肉サンプルの細菌減少率はレタスよりも高かった。 これらの削減能力は、食品サンプルのマトリックスによって影響を受ける可能性があります。 細菌とファージの拡散と接触が限られていることが、効果の低さの原因でした。 ファージ粒子は、水分の存在下でファージの「移動性」が高まるため、乾燥した食品マトリックスと比較して湿った食品表面および液体中の細菌汚染を減らすことが必要になる場合があります。 バクテリオファージと細菌の最初の接触は、多くの場合、拡散とブラウン運動によって起こります。 したがって、低温殺菌牛乳などの液体サンプルでは、​​溶媒分子の動きが制限されているため、米飯などの固体マトリックス上よりもファージがより多く拡散することができました 28,31。

鶏肉の処理では、天然の肉汁が含まれているため、レタスよりも高い減少が見られました。 鶏肉の周囲にスペースがないと、熱と水分が逃げることができず、鶏肉が肉汁で蒸してしまいます。 レタスが乾燥食品マトリックスを持っていることを考慮すると、レタスサンプル中のファージは細菌に到達して侵入することができない可能性があります。 食品表面を横切るファージの受動的移動は、水分が不足しているため制限されます 32。 一方、同じ時間および温度では、ファージ EHEC-S4 を用いた処理では、鶏肉に比べてレタスの細菌の減少が高かった。 レタスのような表面が平らな固形食品では状況が異なり、総表面積とファージ懸濁液からの液体を吸収する能力が鶏肉のような不均一な表面積よりも容易です。 すべての細菌標的に到達するにはファージの分布が物理的に制限されているため、不均一で大きな表面積を持つ食品をファージで処理するのは困難です。 さらに、標的細菌はかなり複雑な食品マトリックス内に埋め込まれており、拡散するファージ粒子から細菌を保護している可能性があります 33。

同様に、28 °C でのインキュベーションは、4 °C でのインキュベーションよりも高い細菌の減少を示しました。 温度はファージの活性にも影響を与える可能性があり、ファージは複製のために細菌宿主の増殖に依存します。 B. セレウス、枯草菌、大腸菌は中温温度範囲で生育し、最適温度は約 37 °C です。 細菌宿主の最適な増殖温度は、ファージ粒子のより良好な複製を促進します。 対照的に、より低い温度では、宿主の増殖速度が低下するため、ファージの複製速度は大幅に低下または停止しました 34。

この研究で分離されたすべてのバクテリオファージは、標的となった食品の腐敗と食品由来の病原菌を効果的に減少させました。 しかし、他の病原体に対するそれらの活性とさまざまな環境条件に対する安定性を決定し、保存代替品として使用したい場合に安全性を確保するためにゲノム特性を特徴付けるには、さらなる研究が必要でした。

バクテリオファージは土壌から単離され、濃縮および精製されました。 力価、宿主範囲、播種効率 (EOP)、最小阻止感染多重度 (miMOI)、および形態を含む、単離されたバクテリオファージの特性評価が決定されました。 単離されたバクテリオファージの食品サンプルへの適用も評価されました。

この研究では、B. cereus ATCC 10876、B. subtilis ATCC 6633、ETEC US Namru-1 および EHEC US Namru-1 を使用して、バクテリオファージ単離のための宿主株として機能しました。 すべての細菌株は、-80 °C で 20% (v/v) グリセロールのアリコート 1.0 mL に保存されました。 細菌培養物を Luria Bertani (LB) 寒天プレート (Oxoid™) に接種し、37 °C で一晩インキュベートしました。 プレートは 4 °C に保たれ、作業培養物として使用されました 35。

インドネシア、バンテン州タンゲラン地区、ケラパドゥア地区のパクロナン・バラット村から収集した有機廃棄物処分場付近の土壌をサンプルとして使用した。 土壌サンプルは研究室に輸送され、バクテリオファージの分離のために処理されました。

各細菌宿主株を、ルリア ベルターニ (LB) ブロス (Oxoid™) 中で、37 °C、120 rpm で一晩インキュベートすることにより、対数増殖期中期 (OD600 = 0.132) まで増殖させました。 6グラムの土壌サンプルと300μLの各細菌培養物を30mLのLBブロスに加えました。 バクテリオファージの増殖を促進するためにサンプルに 10 mM CaCl2 100 μL および 0.5 mM MgSO4 100 μL を補充し 12、37 °C、150 rpm で一晩インキュベートしました。 次にサンプルを 7000 × g で 15 分間遠心分離しました。 上清を孔径０．２２μｍの使い捨てシリンジフィルター（ＨＩＭＥＤＩＡ）を用いて濾過し、残存する細菌細胞を除去した。 濾液を再度 7000 × g で 10 分間遠心分離し、寒天オーバーレイアッセイを使用してバクテリオファージの存在をテストしました6,35。 寒天オーバーレイアッセイは、上部寒天 (LB は 0.6% 寒天からなる) を下部寒天 (LB は 2% 寒天からなる) に注ぐことによって行いました。ここで、150 μL のバクテリオファージ濾液、150 μL の対数期中期細菌宿主培養物、50 μL 10 mM CaCl2 および 50 μL の 0.5 mM MgSO4 を 4 mL の溶融 LB 軟寒天に混合し、LB 寒天プレートに注ぎ、その後 37 °C で一晩インキュベートしました。 明らかなプラーク形成が観察された 36。

単離された溶解性バクテリオファージは、滅菌チップを使用して透明なプラークを静かに刺すことによって精製されました。 次にチップを 10 mL の LB ブロスに置き、ピペットで上下に動かしてバクテリオファージ粒子を放出しました。 対数期中期の細菌宿主培養物 250 μL を LB ブロスに添加することによってバクテリオファージを濃縮し、37 °C、120 rpm で一晩インキュベートしました。 濃縮後、混合物を 7000 × g で 15 分間遠心分離し、孔径 0.22 μm のメンブレンフィルター (HIMEDIA) を使用して上清を濾過して、バクテリオファージストックを得ました。 濾液をリンガー溶液（蒸留水 500 mL 中の NaCl 2.25 g、KCl 0.105 g、CaCl2 0.12 g、NaHCO3 0.05 g）（Oxoid™）中に 1:1（v/v）の比率で 4 °C で保存しました。さらなる分析のための作業ソリューション37、38、39。

力価は、寒天オーバーレイアッセイ法 37 を使用して決定されました。 SM 緩衝液 (50 mM トリス塩酸 (Tris-HCl) [pH 7.5]、0.1 M NaCl、8 mM 硫酸マグネシウム七水和物 (MgSO4・7H2O) および 0.01% (w/ v) ゼラチン)。 各希釈液を寒天オーバーレイアッセイに従ってプレーティングし、37℃で一晩インキュベートしました。 目に見えるプラークの数は、1 ミリリットルあたりのプラーク形成単位 (PFU/mL) として表される 30 ～ 300 プラークの間で計算されました 35。

単離されたバクテリオファージの宿主範囲は、異なる種の宿主細菌、すなわち B. セレウス ATCC 10876、B. サブチリス ATCC 6633、ETEC US Namru-1、EHEC US Namru-2、EPEC from US-Namru 2、および V. を使用して決定されました。単離されたバクテリオファージは、寒天オーバーレイアッセイで感受性をテストするためにさまざまな宿主に対してテストされ、37 °C で一晩インキュベートされました 40。

EOP は寒天オーバーレイアッセイを使用してテストされ、3 回の複製を実行し、標的細菌の平均 PFU を宿主細菌の平均 PFU で割ることによって計算されました 21。

細菌宿主培養物を対数増殖期中期まで増殖させ、0.132 マクファーランド標準に一致するまで懸濁しました。 宿主培養物とバクテリオファージ溶解物を、0.00001 ～ 100 の異なる MOI を含むように希釈しました。それぞれを 100 μL で 96 ウェルマイクロタイタープレートに分配し、37 °C で 10 時間インキュベートしました。 濃度は、マイクロプレートリーダー (Tecan Infinite® M200 PRO)41 を使用して 1 時間ごとに測定しました。

単離されたバクテリオファージの形態は、インドネシア、ジャカルタのエイジマン分子生物学研究所で透過型電子顕微鏡法 (TEM) を使用して決定されました。 約10μLのバクテリオファージをグリッド(400メッシュ)上に滴下し、30秒間放置した。 カーボンコートグリッド上で 5 μL の 2% (w/v) 酢酸ウラニルを使用して、バクテリオファージサンプルをネガティブ染色しました。 グリッドは、JEM-1010 TEM (日本電子、東京、日本) を使用して倍率 30,00042,43 で観察されました。

調理済みの米、低温殺菌牛乳、鶏肉、新鮮なレタスを食品サンプルとして使用しました。 生の鶏肉を1cm×1cmの大きさに切ります。 調理済みの米と生の鶏肉を 50 mL の Falcon チューブ (Corning®) に各チューブあたり約 1 g 入れ、一方、低温殺菌牛乳 (1 mL) を 15 mL の Falcon チューブ (Corning®) に入れました。 これらのサンプルは、121 °C で 15 分間オートクレーブ滅菌して、すべての天然細菌を死滅させました 33。 一方、新鮮なレタスはきれいな水ですすがれ、続いてその表面を96%のアルコールで拭きました。 レタスを小片（１ｃｍ×１ｃｍ）に切り、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））に入れた。 次に、チューブを層流気流 (ESCO) からの UV 光に約 45 分間曝露しました 44。

滅菌後、炊飯米と低温殺菌牛乳の各サンプルに、対数期中期細菌宿主株懸濁液 (B. セレウスおよび枯草菌) 100 μL と単離バクテリオファージ (BC-S1 および BS-S2) 100 μL を接種しました。 ０．１のＭＯＩを含むように希釈した。 鶏肉と新鮮なレタスの各サンプルに、対数期中期細菌宿主株懸濁液 (ETEC および EHEC) 100 μL および MOI 0.001 を含むように希釈した単離バクテリオファージ (ETEC-S3 および EHEC-S4) 100 μL を接種しました。 ETEC の場合は MOI 1、EHEC の場合は MOI 1。 次に、すべてのサンプルを 4 °C および 28 °C で一晩インキュベートしました 45。

インキュベーション後、10 mL の SM バッファーを各サンプルに加え、チューブを約 3 分間ボルテックスしました。 次に、各サンプルを段階的に希釈し、LB 寒天プレート上に広げ、37 °C で一晩インキュベートしました。 陽性対照として、食品サンプルに宿主株のみを接種しました。 陰性対照として、食品サンプルに単離されたバクテリオファージ溶解物のみを接種しました。 コロニーは 30 から 300 コロニーまで計数され、ミリリットルあたりのコロニー形成単位 (CFU/mL) として表されました 46。

３回の複製後にデータを収集し、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてＴｕｋｅｙ'ｓ－Ｂ検定（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、ＩＢＭ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して統計分析を行った。 差異のレベルは P ≤ 0.05 で定義され、各列の異なる文字は他のサンプルとの有意な差異を示しました。 各サンプルの対照と治療の組み合わせについて、その有意な減少は、P ≤ 0.0547 で定義された差のレベルでサンプルのペア T 検定を使用して決定されました。

4 つの溶解性バクテリオファージ、BC-S1、BS-S2、ETEC-S3、および EHEC-S4 を土壌サンプルから回収することに成功しました。 それらは、宿主範囲の狭いスペクトルを有する特異性の高いファージであると考えられており、ファージ ETEC-S3 は B. セレウスに対して効果が低く、ファージ EHEC-S4 は EPEC に対して効果が低いことが判明しました。 この狭い特性は、通常、宿主に対して優れた特異性を有するため、望ましいものです。 TEM を使用することにより、ファージ BC-S1 および BS-S2 をカドウイルス目のメンバーの 1 つとして分類できました。 これらのファージは、4 °C および 28 °C の保存温度で、ファージ BC-S1 と BS-S2 の両方で miMOI 0.1、ファージ ETEC-S3 で miMOI 0.001、ファージ EHEC-S4 で miMOI 1 の食品サンプルの大幅な減少を示しました。 。 これらの結果は、標的の食品腐敗および食中毒菌を減らす上でのバクテリオファージの潜在的な有効性を示しました。 したがって、さらなる研究が期待されています。

この研究では、食品の腐敗と食品由来の病原菌の一部のみをスクリーニングしました。また、分析された食品も限られているため、他の微生物や食品サンプルを調査する必要があります。 その一方で、病原性因子や抗生物質耐性遺伝子などのゲノム特性や、さまざまな食品加工条件におけるこのバクテリオファージの生存性についてもさらに特徴付ける必要があります。

この研究のデータは、要求に応じて責任著者から入手できます。

腸管出血性大腸菌

めっきの効率

腸管病原性大腸菌

腸毒素原性大腸菌

最小感染阻止多重度

ナトリウム-マグネシウム緩衝液

透過電子顕微鏡法

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2021 年国家競争研究助成を通じてこの研究に資金を提供してくださったインドネシア教育省に感謝いたします。

この研究は、インドネシア教育省からの資金提供を受けました-2021。 資金提供者はこの研究に一切貢献していません。

インドネシア・アトマ・ジャヤ・カトリック大学バイオテクノロジー学部食品技術学科、Jenderal Sudirman 51 Street、South Jakarta、DKI Jakarta、12930、インドネシア

クリスティ・アルタウィナタとセシリア・ロレーヌの娘

インドネシア アトマ ジャヤ カトリック大学バイオテクノロジー学部バイオテクノロジー学科修士号、Jenderal Sudirman 51 Street、South Jakarta、DKI Jakarta、12930、インドネシア

ダイアナ・エリザベス・ワトゥランギ

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DEW の個人調査員、研究プロジェクトの構想と設計、データの解釈、研究への助言。 PCA と SL は調査を実施し、データを収集、分析、処理して原稿を作成しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ダイアナ・エリザベス・ワトゥランギへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Artawinata、PC、S. ロレーヌ、Waturangi、DE 食品腐敗および食品由来の病原菌に対する土壌からのバクテリオファージの分離と特性評価。 Sci Rep 13、9282 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36591-6

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受信日: 2022 年 12 月 9 日

受理日: 2023 年 6 月 6 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36591-6

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