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Sep 10, 2023

新型コロナウイルス感染症下でのフェイスマスクからの細菌と真菌の分離

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 11361 (2022) この記事を引用

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新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックにより、人々は公共の場で毎日マスクを着用するようになりました。 ウイルス感染に対するフェイスマスクの有効性は広く研究されていますが、フェイスマスクに付着した細菌や真菌による潜在的な衛生上の問題に関する報告はほとんどありません。 私たちは、(1)マスクに付着した細菌やカビを定量・同定すること、(2)マスクに付着した微生物がマスクの種類や使用方法、個人の生活習慣と関連するかどうかを調べることを目的としました。 ボランティア109人を対象にマスクの使用状況やライフスタイルを調査し、マスクの顔側または外側から細菌や真菌を培養した。 細菌コロニーの数は、外側よりも顔側で多かった。 真菌コロニーの数は、外側よりも表側の方が少なかった。 マスクの使用時間が長くなると、真菌のコロニー数は大幅に増加しましたが、細菌のコロニー数は増加しませんでした。 同定された微生物のほとんどはヒトに対して非病原性であったが、 表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、クラドスポリウムなど、いくつかの病原性微生物が見つかりました。 セレウス桿菌、腐性ブドウ球菌、アスペルギルス、マイクロスポラム。 また、マスクに付着した微生物と移動方法やうがいとの関連性も見つかりませんでした。 私たちは、免疫力が低下している人は、微生物感染を防ぐためにマスクの繰り返しの使用を避けることを提案します。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) の世界的な急速な蔓延と、それに伴うコロナウイルス感染症 2019 (COVID-19) のパンデミックにより、ウイルス感染を防ぐための緊急の取り組みが必要となっています。 呼吸器感染症を予防するための最も伝統的かつ合理的な方法は、フェイスマスクを着用することです。 いくつかの研究グループは、新型コロナウイルス感染症のパンデミックの前に、呼吸器ウイルス感染に対するその有効性を実証しました1,2。 新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミック中、SARS-CoV-2 や飛沫に対するマスク着用の有効性を裏付ける証拠が増えてきました3,4。 しかし、世界保健機関 (WHO) は、フェイスマスクは手指衛生、マスクの適切な使用、廃棄を行った場合にのみ効果があると主張しています5。

日本では日常生活用に、（1）不織布マスク、（2）ポリウレタンマスク、（3）ガーゼまたは布マスクの3種類のマスクが市販されています（図1a、b）。 不織布マスクは、SARS-CoV-2 を含むほとんどの呼吸器微生物による飛沫感染を防ぐために世界中で一般的に使用されています (図 1c)。 ポリウレタンマスクは、特にアジア諸国で花粉症を防ぐために使用されています。 ポリウレタン製マスクは呼吸がしやすく、洗えるため人気が高く、新型コロナウイルス感染症のパンデミック中も何度か再利用された。 ガーゼマスクはあまり普及していませんが、洗って再利用でき、感染予防に効果的です。 このように、新型コロナウイルス感染症パンデミックの初期段階で不織布マスクが不足したため、日本政府は全国民にガーゼマスクを配布した。

フェイスマスクの種類と微生物の大きさ。 (a) 市販されている 3 つの異なるタイプのフェイス マスクの巨視的および顕微鏡的画像。 不織布マスクは 3 層で構成されています。外層と内層の孔径は同じです (50 ～ 150 μm)。 中間層（フィルターとみなされる）の孔径はより小さくなります（5 ～ 30 μm）。 顕微鏡画像は、CCD カメラ DP22 を備えたオリンパス顕微鏡 CX33 によって撮影されました (バー = 500 μm)。 (b) 3 種類のマスクの孔径、厚さ、層、および用途。 製造業者の指示に基づくフェイスマスクの孔径は、(a) (右パネル) に示す顕微鏡画像を使用して確認されました。 (c) 微生物と粒子の標準サイズ (左のパネル) と不織布マスクの中央フィルターの孔径 (5 μm) との比較 (右の図式)。

ウイルス感染に対するフェイスマスクの有効性は広く研究されていますが 3,4、マスク使用における衛生上の問題は依然として不明です。 マスクの基本的な使用方法は使い捨ての不織布マスクです。 ただし、社会経済文化に応じて、不織布マスクを繰り返し使用したり、状況に応じて異なる種類のマスクを使用したりする場合があります。 例えば、日本では不織布マスクの供給不足により、使い捨ての不織布マスクが繰り返し使用されたり、手作りマスクやポリウレタンマスクなどの他の種類のマスクが使用されたりしました6。 マスク不足が解消された後も、使い捨ての不織布マスクや他のマスクを繰り返し使用する人もいる。

環境病原体の中で、ウイルスは宿主細胞に感染しないと複製できません。 ほとんどの細菌や真菌は、条件に応じてさまざまな物質上で生存し、増殖できます。 私たちの日常生活で使用される材料（紙幣や公共交通機関など）の表面には細菌や真菌が広く存在しており、病原性細菌や真菌が検出される可能性があります7、8、9、10。 いくつかの研究では、実験および臨床現場でのマスクの細菌またはウイルス汚染が報告されていますが11、12、13、地域社会の拠点で毎日使用されるマスクにどのような細菌や真菌がどれだけ付着しているかについては研究されていません。 これは、新型コロナウイルス感染症のパンデミック下で無視されている衛生問題です。 マスクは気道、消化管、皮膚への直接の感染源となる可能性があるため、新型コロナウイルス感染症を悪化させる可能性のある細菌や真菌感染を防ぐためにマスクの衛生状態を維持することが重要です。 そこで本研究では、ボランティア109名を対象にマスクの使用状況やライフスタイルを調査した後、マスクから分離した微生物を培養することで、マスクに付着した細菌や真菌を定量・同定することを目的としました。

調査期間中の日本における新型コロナウイルス感染症患者数は比較的少なかったが、公共の場ではほとんどの人がフェイスマスクを着用しており、調査参加者全員がフェイスマスクを着用していた。 まず、男性 63 名 (58%)、女性 46 名 (42%) の参加者 109 名から、マスクの種類とマスクの使用期間に関する情報を収集しました。 参加者の大多数（合計 78%）は不織布マスクを使用しました（図 2a）。 不織布マスク使用者の割合は、他のタイプのマスク使用者の割合よりも大幅に高かった（P < 0.001、数人のガーゼまたは布マスク使用者を除いて、ほとんどがポリウレタンマスク使用者でした）。 マスクの使用期間については、不織布マスク使用者の75％が1日マスクを着用していることがわかった。 対照的に、他のマスクタイプのユーザーの 58% は同じマスクを 2 日以上着用していました (図 2b)。 これは、ポリウレタン、ガーゼ、布製マスクなど、他のタイプのマスクが繰り返し使用できるように設計されているためである可能性があります。 ユーザーは通常、マスクを何度も洗って再利用しました。 一方、マスクの種類と使用時間に関しては、男女間に有意差は見られませんでした（図2a、c）。

マスクの使用状況とマスクの顔側と外側の菌数の調査結果。 (a) 男女参加者における不織布マスクおよびその他のタイプのマスク（その他）の使用状況（n = 109）。 一部のガーゼや布マスクを除いて、「その他」のほとんどはポリウレタンマスクでした。 (b) 不織布、その他のマスクの種類と合計（不織布とその他のマスクの合計）の使用期間。 同じマスクを2日以上着用している「その他の人」の割合(58%)は、不織布マスク使用者の割合(25%、P<0.001)よりも有意に高かった。 (c) 各性別のマスク使用期間 (有意差なし)。 (d、e) 各マスク表面を寒天プレートに押し付けた後、顔側マスクと外側マスク上の細菌 (d) と真菌 (e) を別々に培養しました。 プレートあたりの微生物コロニー数（左パネル）。 箱ひげ図では、十字記号、棒、点はそれぞれ平均値、中央値、外れ値を示します。 マスクの種類とマスクの使用期間に基づいて、顔側（中央のパネル）と外側（右のパネル）の微生物コロニー数を比較しました。 平均値 + 平均値の標準誤差 (SEM)。 統計分析には、対応のある t 検定と Student の t 検定を使用しました。 *P < 0.05; **P < 0.001。

マスク上の微生物は、マスクの顔側と外側を寒天プレートに押し付けることによって培養されました（参加者あたり 2 枚のプレート：顔側と外側）。 寒天プレートを細菌と真菌の増殖のためにそれぞれ 18 時間および 5 日間インキュベートし、コロニーの計数を実施しました。

細菌 (図 2d): サンプルの 99% の表面と 94% の外側で細菌のコロニーが観察されました。 表面側の 1 つのサンプルと外側の 6 つのサンプルではコロニーは見られませんでした。 表面側と外側のコロニー数は、それぞれ 168.6 ± 24.7 と 36.0 ± 7.0 [平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM)] でした。 各個人の顔側と外側のコロニー数を比較したところ、平均コロニー数はマスクの顔側で 13.4 倍高かったことがわかりました (対応のある t 検定、P < 0.001)。 マスクの種類とマスクの使用期間の影響を評価するために、マスクの種類 [不織布、その他、およびすべて（不織布とその他の組み合わせ）]。 使用期間に関わらず、異なるマスクタイプ間でコロニー数に大きな差は見られませんでした。

真菌 (図 2e): サンプルの 79% の表面と 95% の外側で真菌のコロニーが観察されました。 真菌のコロニー数は細菌のコロニー数よりも少なく、表面および外側のコロニー数はそれぞれ4.6±1.9および6.1±1.9(平均±SEM)であった。 細菌コロニーとは対照的に、各個人の真菌コロニー数は、顔側よりも外側で 2.4 倍高かった (対応のある t 検定、P < 0.05)。 参加者が同じマスクを 2 日以上使用した場合、1 日使用した場合と比較して、マスクの外側の真菌コロニーの数が増加しました。 1 日使用後のマスクの外側の真菌コロニー数を除いて、不織布マスク使用者と「その他」マスク使用者の間でコロニー数に統計的な差はありませんでした。

女性は優先的に顔をメイクするため、細菌と真菌のコロニー数が雄と雌で異なる可能性があるかどうかを調べました。 1 日使用者の顔側サンプルの細菌コロニー数のみが大きく異なり、女性の方が低かった (図 S1)。

私たちは、個人のライフスタイルが、宿主 (つまり人間) または環境に由来するマスク上の微生物数に影響を与える可能性があるかどうかを判断しました。 マスク上の微生物のレベルに影響を与えると考えられる環境要因の 1 つは、通勤の交通手段です (図 3a)。 ここでは、（1）電車やバスなどの公共交通機関、（2）交通機関の3つに分類しました。 (2)乗用車やトラックなどの自家用車両。 (3) 徒歩、自転車、バイク。 3 つの輸送システム間で、マスクの両側の細菌または真菌のコロニー数に違いは見つかりませんでした。

生活習慣と微生物コロニー：移動、うがい、納豆摂取。 (a) 通勤に必要な 3 つの交通機関を分類しました。(1) 公共交通機関: 電車および/またはバス。 (2) 自家用車：乗用車およびトラック。 (3) 徒歩/自転車: 徒歩、自転車、バイク。 マスクの顔側または外側の 3 つの輸送カテゴリ間で細菌および真菌のコロニー数に差は見つかりませんでした。 (b) 微生物コロニー数とうがい習慣。 円グラフは参加者のうがい頻度の割合を示しました。 参加者の67％が1日1回以上うがいをしていました。 うがいの頻度に関係なく、参加者間の細菌または真菌のコロニー数に差は見つかりませんでした。 (c) 納豆の摂取と枯草菌のコロニー。 納豆は、寒天プレート上で大きな白いコロニーを形成する枯草菌で発酵させた大豆から作られる伝統的な日本の食品です。 調査によると、参加者の9%が毎日、27%が毎週納豆を食べています。 実験期間中に参加者の19％（109人中21人）が納豆を食べた。 納豆を食べた参加者は、納豆を食べなかった参加者よりも枯草菌コロニーの割合が有意に高かった。

次に、日本で人気のある 2 つの習慣、うがいと納豆摂取を評価しました。 うがい（口や喉の洗浄としても知られる）は、呼吸器感染症を予防すると信じられてきた日本の習慣です14。 参加者のうち、67%は少なくとも1日1回うがいをしており、通常は帰宅時にうがいをしていました。 しかし、うがいの有無に関係なく、参加者間の細菌または真菌のコロニー数に差はありませんでした（図3b）。

納豆は日本の伝統的な発酵食品で、食べるとネバネバして口や箸にくっつきます（図3c）。 納豆は、乾燥条件に耐えることができる有胞子形成細菌である枯草菌で大豆を発酵させることによって作られます。 予想通り、この研究では枯草菌によって形成された大きな白いコロニーが観察されました。 アンケートによると、参加者の9%が毎日、27%が毎週納豆を食べていた。 実験期間中に参加者の19％が納豆を食べました。 納豆を食べた参加者は、食べなかった参加者に比べて、マスクの両側に大きな白い枯草菌のコロニーが発生する頻度が有意に高かった。

細菌培養では、寒天プレート上にさまざまなコロニーが観察されました（図4a）。 形態学的に、コロニーを 4 つの主要なコロニーの形態とその他の形態に分類しました: (1) 小型の白色、(2) 大型の白色、(3) 小型の黄色、(4) 中程度の白色、および中型から大型の黄色を含むその他の形態コロニーのサイズ（小 < 2 mm、中 2 ～ 10 mm、大 10 mm <）、色、頻度に基づいて、ピンクまたはピンクになります（図 4a、b）。 コロニーの頻度は 2 つの式で計算されました。(I) コロニーの発生率 = 目的のコロニーを含むプレートの数 / 総プレート数 (n = 109) × 100。 (II) 合計% = 対象のコロニーの数/各プレートのコロニーの合計数×100 (その後、すべてのプレートからの合計%の平均を計算しました)。 図4aに示すように、ほとんどの参加者は複数のコロニー形態を持っていました。 コロニーの発生率および各コロニーの合計の平均％に関する 4 つのコロニー形態の優位性は、表面側と外側で全体的に類似していました（図 4b）。 小さな白いコロニーが最も頻繁に観察され、発生率と合計%はそれぞれ80%と70%を超えました。

細菌コロニーの形態と同定。 (a) 寒天プレート上のさまざまなコロニーを観察し、形態学的にコロニーを 4 つの主要なコロニー形態に分類しました。 各コロニーを構成する代表的な細菌をグラム染色画像で可視化しました。 (b) 主要なコロニーの形態、同定された細菌、および頻度 (発生率と合計 %)。 (c) 同定された細菌、その局在性、およびヒトにおける病原性。

各コロニーを構成する細菌をさらに決定するために、グラム染色と 16S リボソーム RNA (rRNA) 配列決定を実施しました。 16S rRNA 配列決定により、小さな白いコロニーが主に表皮ブドウ球菌および/または黄色ブドウ球菌から構成されていることが示されました。 小さな黄色のコロニーを形成する主な細菌種は黄色ブドウ球菌でした。 大きな白いコロニーは 2 番目に多く観察されたコロニーで、納豆の成分である枯草菌で構成されていました (図 3c を参照)。 中くらいの白いコロニーは、B. cereus と B. simplex から構成されていました。 B. セレウスはマスクの外側でのみ確認されました。 コロニーの中から、16S rRNA配列決定により他の細菌種も同定しました（図4c）。 同定された細菌のほとんどは非病原性でしたが、以下に示すように、ヒトに潜在的な病原性細菌がいくつか存在しました。 B. セレウス (腸内細菌、食中毒の原因); Staphylococcus saprophyticus (尿路感染症); およびシュードモナス・ルテオラ（日和見病原体）15、16、17。

真菌コロニーを定量した後、胞子形成を誘導するためにさらに 2 日間 37 °C で培養しました。 次に、ラクトフェノールコットンブルー染色を使用して、巨視的なコロニー形態と顕微鏡的な菌糸および胞子の形態に基づいてマスク上の真菌を同定しました。 胞子が形成されないために一部の真菌を同定できませんでしたが、13 属の真菌を同定しました (図 5)。 このうち、参加者の20％以上はマスクの両面にクラドスポリウム属、フォンセカイア属、ムコール属、白癬菌という4つの真菌属が共通して存在していた。 後の 3 つはヒトに対して潜在的に病原性があります (図 5)。

真菌コロニーの特定。 私たちは、巨視的なコロニー形態と顕微鏡的な菌糸および胞子の形態によって真菌を同定しました。 10 個の代表的な真菌画像が表示されました。 白と黄色のバーはそれぞれ 10 mm と 5 mm です。 同定された真菌、この研究における発生率、局在性、および病原性をリストしました。

この研究では、新型コロナウイルス感染症のパンデミック中に世界中で一般的に使用されているフェイスマスクのいくつかの要因と微生物汚染との関連性を実証しました。 調査結果の一部は予想どおりでしたが、いくつかの予期せぬ調査結果もあり、これらは本質的な衛生上の問題として対処する必要があります。 表 1 では、主要な結果を要約し、結果を統計的差異とともに太字で示しました (P < 0.05)。 フェイスマスクのコロニー数は、真菌よりも細菌の方が多かった。 細菌と真菌のコロニー数は、それぞれ顔側と外側で高かった。 マスクの使用期間が長くなると、真菌のコロニー数の増加と相関がありましたが、細菌のコロニー数の増加とは相関しませんでした。 また、不織布マスクの外側には他の種類のマスクよりも菌が少ないこともわかりました。 細菌コロニー数はすべてのマスクタイプで同等でしたが、顔側の細菌コロニー数は男性よりも女性の方が低かったです。

さらに、受信者動作特性（ROC）分析を実行して、表2に示すこの研究で得られたデータ間の関連性を確認しました。曲線下面積（AUC）は、正と負の関連性を示しました（図2e、S1）。 この研究で最も頻繁に検出された真菌であるクラドスポリウム属は、女性でより頻繁に検出されました (女性 58%、男性 29%)。 少なくとも月に1回納豆を食べた参加者が使用したマスクからは枯草菌がより頻繁に検出された。 対照的に、輸送システムは細菌や真菌のコロニー数と関連していませんでした。 これらの結果は、公共交通機関の利用もうがいも細菌または真菌のコロニー数に変化を及ぼさなかった図 3 の調査結果と一致しました。 一方、納豆を食べるとマスク上の枯草菌コロニー数が大幅に増加しました。 枯草菌は急速に増殖し、他の細菌コロニーを打ち負かすのに十分な大きさのコロニーを形成しますが、枯草菌の存在は、この研究で最も頻繁に検出された細菌である表皮ブドウ球菌の数に影響を与えませんでした。 白色培地コロニーの数は、B. subtilis の存在によってマイナスの影響を受けているようでした (AUC = 0.65)。 これは、B. subtilis が、今回の研究の中型の白色コロニーの主成分である B. simplex の増殖を阻害したという以前の報告 18 と一致しています。

この研究で分離された真菌のほとんどは病原性ではなく日和見病原体でしたが（図5）、免疫不全の宿主には不織布マスクを日常的に着用するようアドバイスする必要があります。 参加者の5％のマスクの外側から食中毒菌であるB.セレウスが検出され（図4c）、B.セレウスが糞便から手を介してマスクに付着している可能性があることが示唆された。 手洗いは下痢の発生率を減らすのに効果的であるため、集中的な手洗いが推奨されます19。

マスクの使用期間により細菌コロニーの数が増加する可能性があると予想していましたが、実際はそうではありませんでした。 これは細菌の水分要求によって説明できるかもしれない20,21。 私たちがフェイスマスクを着用している間、マスク空間の下の湿度は約 80% になり、細菌が生存して増殖できる状態になります 22,23。 対照的に、使用済みのマスクを長時間、特に夜間に着用しないと、一晩で乾燥し、乾燥した状態によりマスク上の細菌が死滅する可能性が高くなります。 一方、菌類やその胞子は乾燥に強いため、マスクが乾燥しても生き続けることができます。 これは、マスクの使用時間が長くなると菌が蓄積し、増加する傾向がある理由を説明します。 マスクのタイプ間で微生物コロニー数を比較したところ、不織布マスクと他のタイプのマスクの間で微生物コロニー数に大きな差はありませんでした。 これらの発見は、マスクの外側の真菌コロニー数の増加は、マスクの種類ではなく、マスクの使用期間によるものであることを示唆しています。 洗って再利用可能なマスク（今回の研究では「その他のタイプのマスク」）については、マスク上の微生物負荷を減らすために綿製フェイスマスクの適切な洗浄方法が推奨されています12。 ただし、現在の実験では、洗濯に基づいたマスク上の細菌または真菌のコロニー数に大きな違いは見つかりませんでした（図S2）。 これは、ほとんどのマスク使用者にとってマスクを消毒するための適切な洗浄方法（つまり、100 °C での煮沸、60 °C での洗濯、またはスチーム アイロンでのアイロンがけ）に関する情報が不足していることが原因であると考えられます。

マスク上の微生物分離を報告した研究がいくつかありました。 ベルギーのグループは、13人のボランティアが綿とサージカルマスクを4時間12分間着用した実験環境で、フェイスマスク上の細菌コロニー数を調査した。 著者らは、マスクを（顔側層と外側層に分離せずに）PBSとボルテックスすることによって細菌を採取し、その細菌をブレイン・ハート・インフュージョン（BHI）寒天プレートおよび溶原性ブロス（LB）寒天プレート上で培養した。 彼らは、細菌のコロニー数がサージカルマスクよりも綿マスクの方が高く、サージカルマスクの主な細菌属がブドウ球菌と連鎖球菌であることを発見しました。 私たちの研究ではブドウ球菌も検出されましたが、BHI プレート上で増殖できない連鎖球菌は検出されませんでした。

フェイスマスク上の細菌コロニー数は、毎日使用する人の中では女性よりも男性の方が多かった（図S1）。 この違いは、男性よりも女性の方がより集中的に顔のスキンケアを行っていることに関連しているのではないかと考えられました。 そこで、毎日の顔のスキンケア習慣（1.洗顔方法、2.化粧水・日焼け止めの使用量、3.ファンデーションの使用量の3項目）と、 4時間着用したマスクの細菌および真菌のコロニー数（図S3a）。 主成分 (PC) 1 の分散比率は 44% でした。 PC1 値は、より集中的な顔のスキンケアを反映しています。 ここで、細菌コロニー数と 3 つのスキンケア カテゴリは、それぞれ PC1 値にマイナスとプラスの寄与を示しました。 これは、より集中的な顔のスキンケアにより、フェイスマスク上の細菌が減少する可能性があることを示唆しています。 調査の 3 つのスキンケア カテゴリのうち、ファンデーションの使用が細菌コロニーの数に影響を与えるかどうかをテストしました。 ボランティアを募集し、顔の左半分にのみファンデーションを塗った状態でマスクを4時間着用してもらいました。 フェイスマスクの左半分と右半分の間で細菌コロニー数に違いは見つかりませんでした（図S3b）。 さらに、ローション/日焼け止めの使用も洗顔方法も、統計的にそれ自体で細菌のコロニー数を減少させることはありませんでした (データは示されていません)。 細菌コロニー数の性差に寄与する可能性のある他の要因は調べていませんが、潜在的な要因としては、男性の顔面温度の高さ 24 や汗と皮脂の性差 25 が挙げられます。

この研究にはいくつかの制限がありました。 まず、この研究でのフェイスマスクの調査は包括的ではなく、サンプルサイズも小さかったです。 フェイスマスクは主に 3 つのタイプに分類されていますが、厚さ、生地のコーティング、および微生物の増殖に影響を与える可能性のあるその他の要因に応じてさらに細分化できます。 実験設定では、4 時間着用した後の細菌コロニーの数と組成は、サージカルマスクと綿製フェイスマスクの間で異なりました12。 第二に、すべての実験においてマスクの着脱は素手で行われたため、手に付着した微生物がマスクに移る可能性がありました。 ここでは、通常の生活環境下でマスクに付着した細菌や菌を調べることが目的であるため、実験期間中は意図的に手袋を着用しないように指示しました。 素手で扱われた新しい不織布マスクから検出された微生物コロニーは無視できるほどでした (平均 6.5 個の細菌コロニーと真菌コロニーはありません、データは示されていません)。 最後に、マスク上の微生物をよりよく分離するには、フェイスマスクを洗剤ブロスで徹底的に洗う必要があるという議論があります26。 しかし、この研究では、フェイスマスクを寒天プレートに押し付けるだけで、マスク上の微生物を収集することにしました。 この方法ではマスク素材に大量の微生物が残る可能性がありますが、簡単に除去できる微生物のほうが呼吸器感染症との関連性が高いと考えられます。

この研究では、新型コロナウイルス感染症のパンデミック下でマスクを着用する現在のライフスタイルにおいて新たに浮上した衛生問題に焦点を当てました。 これらの結果は、潜在的な病原体感染を防ぐためのフェイスマスクの使用についての新たな洞察を提供するでしょう。

不織布マスクは3層で構成されており、各層をハサミで切り、手作業で切り離しました。 ガーゼマスクは複数の層で構成されており、そのうちの1層を手動で分離しました。 ポリウレタンマスク（サンプル前処理なし）または不織布マスクとガーゼマスクの各層をCX33顕微鏡（オリンパス、東京、日本）の顕微鏡ステージ上に直接配置し、CCDカメラDP22で10倍の対物レンズを使用して画像化しました（オリンパス）。

この研究は2020年9月から10月にかけて実施されました。参加者は大阪府の近畿大学医学部の医学生109名、男性63名（22.4±0.4歳）、女性46名（21.2±0.3歳、男女間に有意差なし）でした。 。 すべての実験プロトコールは、近畿大学の施設内バイオセーフティ委員会によって承認され、施設のガイドラインに従って実行されました。 すべての参加者からインフォームドコンセントを得ました。 参加者へのアンケートは、年齢、性別、マスクの種類、マスクの使用時間、移動手段、うがい習慣、納豆摂取習慣など。 実験期間中に抗菌薬による治療を受けた参加者がいないことを確認しました。

マスクに付着した微生物を分離・培養するため、マスクの顔側と外側を寒天プレート（直径8.6cm、面積58cm2）にそれぞれ押し付け、すぐに蓋をして培養しました。汚染を避けてください。 培養条件は以下の通りであった：細菌培養については、BHI寒天プレート（栄研化学株式会社、栃木県）、またはレシチンおよびポリソルベート80を含む大豆カゼイン消化ブロス（SCDLP）寒天プレート（栄研化学株式会社） 、）を使用し、好気条件下、37℃で18時間インキュベートしました。 BHI 寒天プレートと SCDLP 寒天プレートの間で同様のコロニー数と形態が見られました。 これは、サージカルマスクサンプルからの細菌コロニー数が BHI 寒天プレートと LB 寒天プレートの間で同等であったという、Delanghe らによって報告された以前の発見と一致しています 12。 したがって、その後のすべての実験では、汎用の増殖培地として広く使用されている BHI 寒天プレートを使用することにしました。 培養期間が長くなると (2 日を超える)、急速に増殖する細菌である枯草菌が他の細菌よりも増殖し、その結果、増殖の遅い細菌の検出が困難になります。 真菌の培養には、サブローブドウ糖寒天プレート (日水製薬株式会社、東京、日本) を使用し、好気条件下、25 °C で 5 日間インキュベートしました。 一次培養後、コロニーの形態を評価し、コロニーの計数を行いました。 中間層（フィルター層）上の微生物の存在をテストしましたが、少数の細菌および真菌コロニーのみが検出されました（平均±SEM：細菌コロニー、6.3 ± 4.9、真菌コロニー、1.0 ± 0.5）。 そこで、この研究ではマスクの顔側と外側の微生物コロニーに焦点を当てることにしました。

細菌：培養プレートから94個のコロニーを収集し、DNAを単離し、口腔微生物叢解析センター（高松市）のMiSeq（イルミナ、カリフォルニア州サンディエゴ）による16SリボソームRNA（rRNA）配列決定を実施しました。 また、グラム染色用にスライドガラス上に細菌塗抹標本を作成し（富士フイルム和光、大阪、日本）、CCD カメラ DP22 を備えた CX33 顕微鏡を使用して顕微鏡画像を撮影しました。

真菌: 培養したすべてのプレートから、さまざまな種類の真菌コロニーを含む代表的な寒天プレートを選択しました。 さらに胞子形成を誘導するために培養プレートを 37 °C で 2 日間インキュベートし、菌をラクトフェノールコットンブルー (武藤純薬株式会社、東京、日本) で染色し、コロニーの形態と顕微鏡に基づいて菌を同定しました37。 。

ソフトウェア RStudio (バージョン 1.4.1106) および Exploratory (Exploratory, Inc., CA) を使用して PCA を実行しました。 統計分析のために、対応のある t 検定、Student の t 検定、および χ2 検定を実行しました。 この研究で得られたデータ間の相関関係を判断するために、AUC を計算することで要因と結果の関連性を評価する ROC 分析を実施しました。 AUC が 1 に近い場合は強い関連があることを示し、0.5 未満の場合は関連がないことを示します。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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マスク実験にボランティアとして協力していただいた近畿大学医学部医学科2年生の皆さんに感謝いたします。 素晴らしい技術支援をしていただいた崎山奈美恵さんに感謝いたします。

日本学術振興会 科学研究費補助金 科研費、20K07455 (IT)、18K07379 (AMP)、21K07287 (AMP)。 オール近畿大学新型コロナウイルス対策支援プロジェクト（AMP、IT）。 日本医療研究開発機構 (AMED) の新興・再興感染症研究プログラム (助成番号 19fk0108168s0101 (IT))。

〒589-8511 大阪狭山市大野東377-2 近畿大学医学部微生物学教室

Ah-Mee Park, Sundar Khadka, Fumitaka Sato, Seiichi Omura, Mitsugu Fujita, Kazuki Hashiwaki & Ikuo Tsunoda

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概念化: AMP、IT 方法論: AMP、SK 調査: AMP、SK、MF、FS、SO 可視化: AMP、KH、IT 資金調達: AMP、IT プロジェクト管理: AMP、IT 監督: AMP、IT 執筆—原案: AMP、IT 執筆 - レビューおよび編集: SK、MF、FS、SO

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転載と許可

Park, AM.、Khadka, S.、Sato, F. 他新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミック下でのフェイスマスクからの細菌と真菌の分離。 Sci Rep 12、11361 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-15409-x

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受信日: 2022 年 3 月 1 日

受理日: 2022 年 6 月 23 日

公開日: 2022 年 7 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15409-x

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科学レポート (2023)

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