ベータ2

npj morbo di parkinson

npj パーキンソン病第 8 巻、記事番号: 61 (2022) この記事を引用

1477 アクセス

10 オルトメトリック

メトリクスの詳細

β2-アドレナリン受容体（β2AR）アゴニストは、パーキンソン病（PD）の発症リスク低下と関連しており、α-シヌクレイン mRNA（Snca）とタンパク質（α-syn）の両方の発現を低下させると仮説が立てられています。 Snca mRNA および α-syn タンパク質のレベルに対する β2AR アゴニストクレンブテロールの効果は、2 つの独立した研究室によって in vivo (ラットおよびマウス) およびラットの初代皮質ニューロンで評価されました。ラットにクレンブテロールを単回急性用量投与した後、黒質におけるSnca mRNAのわずかな減少が観察されましたが、この減少は複数回投与後も維持されませんでした。対照的に、α-syn タンパク質レベルは、単回投与パラダイムと複数回投与パラダイムの両方で変化しませんでした。さらに、クレンブテロールは、培養ラット一次皮質ニューロンのSncaを減少させず、マウスのSncaまたはα-synを減少させませんでした。さらに、単回投与パラダイムと比較して、反復投与により、げっ歯類の血漿および脳組織中のクレンブテロールのレベルが実質的に低下しました。この前臨床研究におけるSncaの一時的な減少とα-synタンパク質への影響がないという我々の観察に基づいて、これらのデータは、クレンブテロールがPDに対する実行可能な疾患修飾戦略ではない可能性が高いという結論を裏付けるものである。

細胞内レビー小体 (LB) の形成と蓄積は、パーキンソン病 (PD) の重要な病理学的特徴です。 LB の主成分はタンパク質 α-シヌクレイン (α-syn)、具体的には α-syn であり、セリン 129 (pSyn)1、2、3、4、5 でミスフォールド、凝集、リン酸化されます。 α-syn の凝集は、特発性およびほとんどの家族性型の PD で発生します。 α-syn (以下、ヒトについて説明する場合は SNCA、げっ歯類について説明する場合は Snca と呼びます) をコードする遺伝子の変異、および SNCA の重複および三重重複は、α-syn の凝集傾向を増加させる可能性があります 6、7、8、9。 SNCAの重複または三重化は遺伝子量効果をもたらし、重複と比較して三重化の方が症状の発現がより早くなり、病気の進行がより速くなります10。

α-syn は病態に関連した凝集体を形成する病理学的原因として一般に議論されていますが、単量体の可溶型は神経機能の重要な構成要素です。 α-syn は、予測される機能の中でもとりわけ、シナプス小胞輸送と神経伝達、ミトコンドリア機能、ドーパミン生合成とプロセシング、シャペロンタンパク質機能、DNA 修復、遺伝子発現において役割を持つことが提案されています 11,12,13,14,15,16。 17、18、19、20。 α-syn のレベルが不十分だと、ニューロンやニューロン機能に悪影響を与える可能性があり、そのため、α-syn を完全にノックダウンまたは除去すると、望ましくない副作用を引き起こす可能性があります 21,22。実際、トランスジェニックマウスモデルは、Snca のみのノックアウトでは効果を生み出すには不十分であり 23,24、強力な欠損を生み出すには Snca、Sncb、および Sncg の同時ノックアウトが必要であることを示しています 25,26,27。これらのトランスジェニックモデルには、出生時からの Snca の欠如に関連する重大な代償機構に関する注意が伴い、Snca-/- マウスでは 369 もの差次的に発現する遺伝子が報告されています 28。

累積データは、α-syn の中程度の減少が治療戦略として最良の可能性を秘めていること、つまり、ニューロンの潜在的な機能喪失効果を回避するために必要な臨界閾値を維持しながら α-syn レベルを減少させることを示唆しています。それにもかかわらず、脳内のα-syn レベルの調節は簡単ではありません。 shRNA またはアンチセンスヌクレオチドを介して遺伝子発現を改変した動物モデルの結果はまちまちであり、毒性を示す研究もあれば 29,30、毒性を示さない研究もあります 31,32,33,34。別の方法として、薬学的介入は、α-syn の適度ではあるが生理学的に意味のある減少をもたらす優れたアプローチを提供する可能性があります。

β2-アドレナリン受容体（β2AR）を標的とする薬剤は、α-syn レベルを調節し、PD リスクに影響を与えることが報告されています 35、36、37、38、39、40。集団ベースの研究では、β2AR アゴニストの使用と PD リスクの減少との関連性が報告されています 37,38 が、他の研究者はこれらの結果に異議を唱えており、β2AR アゴニスト単独では PD リスクに影響を及ぼさないことが判明しています 39,40。これらの関連研究に関する一貫性のない結果を超えて、げっ歯類および細胞培養における前臨床証拠は、β2AR に作用する薬物が α-syn 発現に影響を与える可能性があることを示唆しています 37。具体的には、β2AR アゴニストは、in vivo および in vitro で Snca mRNA および α-syn タンパク質を減少させることが報告されています 37。逆に、β2AR アンタゴニストは培養中の Snca mRNA および α-syn タンパク質を増加させることが報告されています 37。 β2ARを介したα-synレベルの変化は、Sncaプロモーターおよびエンハンサー部位に沿ったH3K27のアセチル化または脱アセチル化による転写制御を通じて起こると仮説が立てられています。 β2ARアゴニストまたはβ2ARアンタゴニストは、それぞれ許容アセチル化H3K27の減少または増加をもたらし、Snca37の転写に影響を与えます。さらに、β2AR アゴニストであるクレンブテロールは、PD の特徴を再現するモデルにおいて有益であることが報告されています。具体的には、クレンブテロールは、SNCA三重複製ヒトiPS細胞においてSNCA mRNAおよびα-synタンパク質を減少させ、PD37の1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）マウスモデルにおいて神経変性を防止する。

現在の一連の実験は、ミシガン州立大学 (MSU) とバイオジェンの研究室で独立して行われた研究の集大成です。これらの実験では、β2AR アゴニスト、特にクレンブテロールが齧歯動物および培養細胞において Snca mRNA および α-syn タンパク質を減少させるという最初の発見を再現し、それを基礎にしようとしました 37。しかし、ラットに使用されたクレンブテロール投与パラダイムでは、急性研究におけるα-synタンパク質の減少や、複数回投与後のSncaまたはα-synタンパク質の変化は生じませんでした。マウスでの直接複製研究はラットで観察された結果を反映しており、クレンブテロールの単回または複数回投与後にSncaまたはα-synタンパク質の有意な減少は観察されませんでした。さらに、ラットの初代皮質培養物では Snca に変化はありませんでした。総合すると、結果は、クレンブテロール後のα-syn 転写物の減少は一時的なものであり、α-syn タンパク質の存在量の減少をもたらさないことを示唆しています。したがって、我々は、クレンブテロールが効果的な疾患修飾性PD治療法につながる可能性は低いと結論付けています。

我々は、黒質（SN）のチロシンヒドロキシラーゼ（TH）の免疫組織化学（IHC）と組み合わせたin situハイブリダイゼーション（Adrb2）を用いて、ラット黒質線条体ドーパミンニューロンがβ2ARを発現していることを最初に確認した。個々のTH免疫反応性(THir)黒質ニューロン内に豊富なAdrb2 mRNA点が観察されました(図1a)。

ラットに 10、20、または 40 mg/kg のクレンブテロール (clen) または生理食塩水ビヒクル (veh) を 1 回腹腔内注射し、注射の 24 時間後に組織を収集しました。未処理ラットのSNpcのチロシンヒドロキシラーゼ（TH）免疫反応性ニューロン内に共局在する、β2ARをコードするAdrb2 mRNAのin situハイブリダイゼーションの代表的な画像。 b Snca は Gapdh に正規化され、ddPCR によって測定されました。 c SN から単離された易溶性 α-syn 画分。 d 最初は不溶性の α-syn 画分を SN から単離し、より強力な溶解バッファーで可溶化しました。 e 線条体から単離された易溶性のα-syn 画分。 f 線条体から単離され、より強力な溶解バッファーで可溶化された、最初は不溶性の α-syn 画分。すべてのタンパク質画分をウェスタンブロットで測定し、コントロールのパーセントとしてグラフ化しました。代表的なブロットをそれぞれのグラフの下に示します。列はグループの平均を示し、丸は個々のデータポイントを示します (外れ値を除去する前のグループあたり n = 10)。誤差バーは平均の ±1 標準誤差を示します。アスタリスクは有意性 (p ≤ 0.05) を表します。外れ値は、中央値法からの絶対偏差に基づいて削除されました。 b では、veh、10、および 40 mg/kg グループから 1 つのサンプルが除去され、20 mg/kg グループから 2 つのサンプルが除去されました。他の外れ値は削除されませんでした。

皮下注射と比較して、CSF中に有意に高いレベルのクレンブテロールをもたらす腹腔内（ip）注射に基づいて（補足図1）、ip投与が選択されました。以前の研究37を反映するために、10、20、または40 mg/kgのクレンブテロールまたはビヒクル（生理食塩水）を単回注射（腹腔内）投与し、Snca mRNAおよびα-synタンパク質をSNで評価し、α-synタンパク質をSNで評価しました。 24 時間後の線条体 (実験計画、補足図 2 を参照)。 10または20 mg/kgのクレンブテロールを単回注射したラットにおいて、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）を使用して、SNにおけるSncaの緩やかではあるが有意な減少が観察されました（図1b）。 Sncaは10 mg/kgおよび20 mg/kgの用量の両方で約20％減少しましたが、最高用量の40 mg/kgを投与されたラットではSncaの有意な減少は観察されませんでした（図1b）。

α-syn タンパク質の測定のためのラットの黒質および線条体サンプルの調製は、2 段階の溶解を使用して実行されました。最初のステップでは、弱い溶解バッファーと乳棒ホモジナイズを使用して、以前に報告された「可溶性 α-syn」と呼ばれるタンパク質単離手順を再現しました 37。第 2 ステップでは、強力なラジオ免疫沈降アッセイ (RIPA) バッファーを使用し、第 1 ステップで残ったペレット (「不溶性 α-syn」と呼ばれます) を超音波処理しました。いかなる用量のクレンブテロールを使用しても、ラットへのクレンブテロールの単回腹腔内注射がSN中の可溶性または不溶性α-synタンパク質レベルに及ぼす影響は観察されませんでした（図1c、d）。同様に、線条体における易溶性および不溶性のα-synのウェスタンブロットでは、クレンブテロール投与による変化は示されませんでした（図1e、f）。

観察された転写物の減少とは対照的に、クレンブテロールの単回投与後にα-synタンパク質の減少が観察されないのは、24時間間隔にわたるタンパク質の分解/クリアランスが不十分であることが原因である可能性があります。これは、十分な時間があれば、α-syn タンパク質の減少が観察できる可能性があることを示唆しています。したがって、長期間の複数回投与パラダイムにわたるクレンブテロール投与の影響を判断するために、1週間のクレンブテロール反復投与によるSnca mRNAおよびα-synタンパク質レベルを調べました（補足図3）。報告されている経口投与によるクレンブテロールの血漿中半減期 30 時間に基づいて、ラットに 48 時間ごとに腹腔内注射を 4 回受けました 41。クレンブテロール群のラットは、注射シリーズの2、4、6、7日目に、3つの用量すべてで対照と比較して顕著な体重減少を示しました（補足図4）。 Snca mRNAを調べたところ、単回注射パラダイムの結果とは対照的に、複数回注射パラダイムではどの用量でもSNのSncaに変化は観察されませんでした（図2a）。 SNおよび線条体の可溶性および不溶性α-synのウェスタンブロットでも、クレンブテロールの投与量に応じた変化は見られませんでした（図2b〜e）。

ラットには、48 時間ごとに 10、20、または 40 mg/kg のクレンブテロール (clen) または生理食塩水ビヒクル (veh) が腹腔内注射されました。組織は、最後の注射から 24 時間後の 7 日目に収集されました。各注射の前に、ラットの体重を測定して、投与量に必要な薬物またはビヒクルの量を計算した。 a Snca は Gapdh に正規化され、ddPCR によって測定されました。 b SN から単離された易溶性 α-syn 画分。 c 最初は不溶性の α-syn 画分を SN から単離し、より強力な溶解バッファーで可溶化しました。 d 線条体から単離された易溶性 α-syn 画分。 e 線条体から単離され、より強力な溶解バッファーで可溶化された、最初は不溶性の α-syn 画分。すべてのタンパク質画分をウェスタンブロットで測定し、コントロールのパーセントとしてグラフ化しました。代表的なブロットをそれぞれのグラフの下に示します。列はグループの平均を示し、丸は個々のデータポイントを示します (外れ値を除去する前のグループあたり n = 10)。誤差バーは平均の ±1 標準誤差を示します。アスタリスクは有意性 (p ≤ 0.05) を表します。外れ値は、中央値法からの絶対偏差に基づいて削除されました。 a では、20 mg/kg グループから 2 つのサンプルが除去され、40 mg/kg グループから 1 つのサンプルが除去されました。 b では、40 mg/kg グループから 2 つのサンプルを取り出しました。 c および e では、40 mg/kg グループから 1 つのサンプルが除去されました。他の外れ値は削除されませんでした。

Mittal et al.37 は以前に、マウスにおける α-syn 発現に対するクレンブテロールの影響を調査しました。彼らの研究では、マウスに生理食塩水に溶解したクレンブテロール (10 mg/kg) を 1 回腹腔内注射するか、対照として等量の生理食塩水を投与しました。動物は注射後 24 時間処理され、SN37 では Snca mRNA と α-syn タンパク質の両方の 20 ～ 50% の減少が報告されました。クレンブテロールの効果がマウスに特異的であるかどうかを検討するために、以前に報告されたものと同じパラメーターを使用して研究を実行しました (補足図 2)37。

SNでは、クレンブテロール処置動物のSnca mRNAは減少する傾向がありましたが、その効果は有意ではありませんでした（図3a）。同じ単回用量パラダイムと時点を使用してバイオジェンで実施された反復研究の結果でも、Snca mRNAの変化は観察されませんでした（図3b）。ウェスタンブロットによる α-syn タンパク質の評価は、2 段階の溶解を使用して再度実行されました。可溶性画分と不溶性画分の両方で、SN の α-syn タンパク質の減少は観察されませんでした (図 3c、d)。線条体では、クレンブテロールグループで可溶性α-synがわずかではあるものの有意に増加し、対照の109.1％±2.41でした（図3e）。しかし、クレンブテロール処置群では不溶性α-synの検出可能な増加はありませんでした（図3f）。

マウスに、10 mg/kg クレンブテロール (clen) または生理食塩水ビヒクル (veh) を単回腹腔内注射し、注射の 24 時間後に組織を収集しました。 a Snca は Gapdh に正規化され、ddPCR によって測定されました。 b Biogen lab の結果。Snca mRNA は Rpl13a mRNA に対して正規化され、RT-qPCR によって測定されました。 c SN から単離された易溶性 α-syn 画分。 d 最初は不溶性の α-syn 画分を SN から単離し、より強力な溶解バッファーで可溶化しました。 e 線条体から単離された易溶性のα-syn 画分。 f 線条体から単離され、より強力な溶解バッファーで可溶化された、最初は不溶性の α-syn 画分。すべてのタンパク質画分をウェスタンブロットで測定し、コントロールのパーセントとしてグラフ化しました。代表的なブロットをそれぞれのグラフの下に示します。列はグループの平均を示し、丸は個々のデータポイントを示します (外れ値を除去する前のグループあたり n = 10)。誤差バーは平均の ±1 標準誤差を示します。アスタリスクは有意性 (p ≤ 0.05) を表します。外れ値は、中央値法からの絶対偏差に基づいて削除されました。 a では、2 つのサンプルが veh から除去され、1 つのサンプルが clen グループから除去されました。他の外れ値は削除されませんでした。

クレンブテロールの効果の発現が遅れる可能性を考慮して、マウスに10 mg / kgのクレンブテロールを1週間にわたって複数回注射した場合の影響を調べました（補足図3）。 1週間の治療パラダイム後のSNにおけるSnca mRNAには変化はありませんでした（図4a）。同様に、ウェスタンブロットにより、可溶性画分または不溶性画分のいずれにおいても、マウスSNのα-synタンパク質に対する複数回の注射の影響は観察されませんでした（図4b、c）。同様に、1週間後の線条体のα-syn不溶性または不溶性画分には変化はありませんでした（図4d、e）。ビヒクルと比較して、クレンブテロールを投与されたマウスは、この投与パラダイムの初期に体重が減少しましたが、注射の4日目以降は回復し、顕著な体重減少は示されませんでした（補足図4）。

マウスには、48 時間ごとに 10 mg/kg のクレンブテロール (clen) または生理食塩水ビヒクル (veh) の腹腔内注射を受けました。組織は、最後の注射から 24 時間後の 7 日目に収集されました。 a Snca は Gapdh に正規化され、ddPCR によって測定されました。 b SN から単離された易溶性 α-syn 画分。 c 最初は不溶性の α-syn 画分を SN から単離し、より強力な溶解バッファーで可溶化しました。 d 線条体から単離された易溶性 α-syn 画分。 e 線条体から単離され、より強力な溶解バッファーで可溶化された、最初は不溶性の α-syn 画分。すべてのタンパク質画分をウェスタンブロットで測定し、コントロールのパーセントとしてグラフ化しました。代表的なブロットをそれぞれのグラフの下に示します。列はグループの平均を示し、丸は個々のデータポイントを示します (外れ値を除去する前のグループあたり n = 10)。誤差バーは平均の ±1 標準誤差を示します。アスタリスクは有意性 (p ≤ 0.05) を表します。外れ値は、中央値法からの絶対偏差に基づいて削除されました。 a では、veh グループと clen グループから 1 つのサンプルが削除されました。他の外れ値は削除されませんでした。

元のレポートでは酵素結合免疫測定法 (ELISA) によって α-syn タンパク質の減少が示されていたため 37、市販の ELISA を使用してマウスコホートも分析しました。急性治療マウスの24時間時点で、SNまたは線条体のいずれかにおける可溶性または不溶性α-synタンパク質レベルに対するクレンブテロールの影響は観察されませんでした（図5a、c、e、g）。 1週間のパラダイムでは、SNの可溶性または不溶性α-synタンパク質レベルに変化はなく、線条体における可溶性α-synタンパク質レベルにも変化はありませんでした（図5b、d、f）。線条体中の不溶性画分のα-synタンパク質の有意な増加が観察されました（ビヒクル対照群の27.9±1.6pg/μgと比較して、1週間のクレンブテロール群では34.9±1.9pg/μg）（図5h）。。元のレポートの ELISA およびウェスタンブロットの一部では、我々が使用した (Abcam、ab212184) とは異なる α-syn 抗体 (Millipore、MABN1817、α-syn クローン 2F12) が使用されました。残念ながら、この他の抗体を使用して α-syn レベルの 2 回目の評価を行うための SN からのライセートが残っていませんでした。しかし、この違いに対処するために、線条体からの可溶性画分をさらに調査しました。繰り返しますが、MABN1817抗体を使用した24時間または1週間のパラダイムでは、層可溶性画分のウェスタンブロットによる変化はありませんでした（補足図5）。

市販のELISAキットを使用して、1日および1週間のマウス10 mg/kg投与パラダイムからの血漿および残りのタンパク質溶解物中のα-synを測定した。 a 1 日、b 1 週間後に SN から単離された易溶性 α-syn。最初は不溶性の α-syn を SN から単離し、c 1 日、d 1 週間でより強力な溶解バッファーで可溶化しました。 e 1 日および f 1 週間後の線条体からの可溶性 α-syn。 g 1 日および h 1 週間における線条体からの不溶性 α-syn。 i 1日およびj 1週間の血漿中の総α-syn。列はグループの平均を示し、丸は個々のデータポイントを示します (外れ値を除去する前のグループあたり n = 10)。誤差バーは平均の ±1 標準誤差を示します。アスタリスクは有意性 (p ≤ 0.05) を表します。外れ値は、中央値法からの絶対偏差に基づいて削除されました。 a では、外れ値は除去されませんでした。veh グループのサンプルサイズが小さかったのは、アッセイに残されたタンパク質の量が限られていたためです。 b では、veh グループと clen グループから 1 つのサンプルが削除されました。 i では、j 1 つのサンプルが veh グループから削除されました。他の外れ値は削除されませんでした。

私たちのサンプル調製と Mittal らのサンプル調製の間に残る 1 つの違いは、脳組織の α-syn レベルに寄与する可能性のある血液中の α-syn タンパク質の可能性を除去するために、私たちの研究のすべてのラットとマウスに生理食塩水を灌流したことです。。クレンブテロールが血中α-synタンパク質レベルに影響を与えるかどうかを判断するために、血漿中のα-synタンパク質を測定しました。 10 mg/kgのクレンブテロール注射後の24時間または1週間のパラダイムのいずれにおいても、マウスの血漿α-synタンパク質レベルに差は観察されませんでした（図5i、j）。

まとめると、我々は、ラットとマウスの両方において、クレンブテロールのα-synを減少させる能力は、1回の注射後のα-syn転写物の減少に限定されており、複数回注射のパラダイムではもはや観察できないことを観察した。 β2AR は、慢性的なアゴニスト曝露により脱感作を受けやすい 42。 β2AR の脱感作に続いて、受容体の内部移行および/またはダウンレギュレーションが起こる可能性があります。 β2AR の潜在的な変化を調べるために、線条体と海馬の組織をまず強力な溶解バッファーでホモジナイズし、ウェスタンブロットによって評価しました。総β2ARタンパク質は、線条体および海馬における1週間のクレンブテロール処理後も変化しませんでした（補足図6a、b）。内部移行した β2AR のマーカーは、G タンパク質共役型受容体キナーゼによるセリン 355/356 のリン酸化です 43。リン酸化β2AR（ser355/356）は、線条体および海馬において1週間のクレンブテロール処理後も変化しなかった（補足図6c、d）。総合すると、これらの結果は、クレンブテロールの反復投与によってβ 2AR 受容体の内部移行またはダウンレギュレーションが起こったことを裏付けるものではありません。しかし、これらの発見は、アゴニストの結合により弱い反応が生じる機能的脱感作を排除することはできません。

私たちが調べた追加のエンドポイントは、MPTP の有毒代謝物である MPP+ の取り込みに必要なドーパミントランスポーター (DAT) のタンパク質レベルでした44,45。クレンブテロールの使用に関連してこれまで測定されていなかった、クレンブテロールを介した DAT の減少は、MPTP マウスモデルにおけるクレンブテロールについて報告されている神経保護効果を説明できる可能性があります 37。マウスの線条体では、クレンブテロールの10 mg / kgの単回注射により、対照と比較してDATタンパク質レベルが約23％大幅に減少しました（補足図7a）。線条体 DAT のこの減少は、複数回の注射パラダイムでは観察されませんでした（補足図 7b）。さらに、線条体DATタンパク質は、クレンブテロールを1回注射した後でも、複数回注射した後でも、ラットでは変化しませんでした（補足図7c、d）。

血漿および脳（海馬）中のクレンブテロールを測定して、ラットとマウスの両方に存在するレベルを決定しました。ラットにおける単回および複数回の注射パラダイムの両方において、血漿および組織において結合および非結合クレンブテロールレベルの用量依存的な増加が観察された（図６ａ、ｃ、ｅ）。驚くべきことに、複数回注射を受けた動物で測定されたクレンブテロールレベルは、単回注射を受けた動物よりも有意に低かった(図6a、c、e)。単回注射グループの結合画分のクレンブテロールレベルは、それぞれ 10、20、および 40 mg/kg の複数回注射グループよりも約 7、14、および 32 倍高かった。単回注射グループの非結合画分のクレンブテロールレベルは、それぞれ 10、20、および 40 mg/kg の複数回注射グループよりも約 4、10、および 10 倍高かった。単回注射グループの血漿中の総クレンブテロールレベルは、それぞれ 10、20、および 40 mg/kg の複数回注射グループよりも約 4、3、および 10 倍高かった。血漿および組織中のクレンブテロールレベルの用量依存的な増加が予想されましたが、単回注射と比較した一連の注射後のレベルの低下は予想されませんでした。同様にマウスでも、血漿および組織中のクレンブテロールは、単回注射と比較して複数回注射後の方が低くなりました（図6b、d、f）。単回注射グループでは、複数回注射グループと比較して、血漿中の結合および非結合画分のクレンブテロールレベルはそれぞれ約 7 倍、および 3 倍高かった。単回注射群と複数回注射群の両方が最後の注射から約 24 時間後に屠殺されたことを考えると、蓄積により複数回注射群のクレンブテロールレベルは同等かそれより高くなることが予想されます。

海馬からの組織、および 1 日および 1 週間パラダイムのマウスおよびラットからの血漿を収集しました。組織を処理して、タンパク質と相互作用しているクレンブテロール（クレン）と相互作用していないクレンブテロール（クレン）を分離し、それぞれ結合クレンブテロール画分と非結合クレンブテロール画分を生成しました。ラットaとマウスbにおける結合クレンブテロール。 c ラットおよび d マウスにおける結合していないクレンブテロール。 eラットおよびfマウスの血漿中の総クレンブテロール。列はグループの平均を示し、丸は個々のデータポイント (グループあたり n = 5) を表し、エラーバーは平均の ±1 標準誤差を表します。列を接続する線は、グループ間の有意性を示します (p ≤ 0.05)。

Mittal ら 37 と同様に、E18 Sprague-Dawley ラット胚からの初代ラット皮質ニューロンをクレンブテロール (1、5、10、または 20 μM) で 2 日間処理し、RT-qPCR によって Snca mRNA を評価しました。以前の報告 37 とは対照的に、クレンブテロールはどの濃度でも α-syn 転写物に影響を与えませんでした (図 7a)。対応する細胞生存率アッセイでは、使用したクレンブテロールのどの濃度でも重大な毒性は示されませんでした。 (図7b)。

E18ラット初代皮質ニューロンをクレンブテロールまたはビヒクルで処理した。 a DIV11 で曝露され 2 日後に採取されたニューロンにおいて RT-qPCR によって測定された Snca。 b DIV11で曝露し、2日後に調べた一次ニューロンの細胞生存率。列はグループの平均を示し、丸は同じ実験からの個々のデータ点を示し、エラーバーは平均の±1標準誤差を示します。アスタリスクは有意性 (p ≤ 0.05) を表します。

PDおよびPDリスクに関するβ2ARアゴニストおよびアンタゴニストの使用は議論のテーマとなっている。 β2AR アゴニストは、ノルウェー人集団における PD リスクを軽減することが最初に示されました 37。米国コホートで調査し、喫煙について調整した場合、β2AR アゴニストの使用は PD リスクに影響を与えませんでした 39。イスラエルの別のコホートも、喫煙、アルコール摂取、居住地、その他の変数が分析に考慮されていた場合でも、PDリスクを低下させるためにβ2ARアゴニストを使用したことを報告している38。ごく最近、β2AR アゴニストは、非糖尿病患者の PD リスクを低下させる一方で、糖尿病患者のリスクを増加させることが報告されました 40。 β2AR アンタゴニストと PD に関しては、リスク増加との関連を示唆する報告 37,38、関連性を示さない報告書 46、および曝露と PD 診断の間に 5 年の遅れがある持続的曝露を調整するまで関連性が観察された報告書がある。または特定のアンタゴニストであるプロプラノロール35、36、39、40。 PDリスクの増加に関連するプロプラノロールの使用には、それ自体がPDリスクの増加と関連する本態性振戦の治療に使用されるという注意が伴います38、39、40、47。要約すると、集団関連データには明確なコンセンサスはありませんが、PD 治療における β2AR アゴニストの可能性を判断するための重要な洞察を提供するには、対照実験室研究が重要です。

前臨床研究において、クレンブテロールはマウスおよび細胞培養研究において、ヒストン修飾を通じてα-syn 発現を減少させることが示されており、その結果、単回投与後に Snca mRNA および α-syn タンパク質が減少します 37。本研究では、Mittal らの観察を部分的に再現することができました 37。具体的には、Snca mRNAの大幅な減少または減少傾向が観察されましたが、いずれの種でも、ラットまたはマウスへのクレンブテロールの単回注射後のα-synタンパク質の減少は検出されませんでした。 Mittal ら 37 によってこれまで調査されていなかった、Snca mRNA および α-syn タンパク質に対するクレンブテロールの反復投与の影響を理解するために、我々は複数回の注射パラダイムでの影響も調査しました。クレンブテロールを繰り返し投与しても、マウスでもラットでも転写物やタンパク質は減少しません。さらに、クレンブテロールも同様に初代皮質培養物中の Snca mRNA に影響を与えません。したがって、我々の今回の結果は、クレンブテロールの単回投与でSnca mRNAを減少させることができるという以前の発見を再現しているが、クレンブテロールの1週間の反復投与の効果を含めて分析を拡張することにより、Snca mRNAの減少は短期的に現れることが明らかになった。重要なことに、どちらのクレンブテロール投与パラダイムでも、α-syn タンパク質の減少に対する影響は観察されませんでした。

β2AR アゴニストであるサルメテロールとクレンブテロールは、MPTP に対して神経保護特性を有することが示されています 37,48。ただし、β2AR アゴニストがこの神経保護を提供するメカニズムは不明であり、結果にはいくつかの注意点が伴います。どちらの報告でも、β2AR アゴニストは MPTP の注射前および注射中に投与され、MPTP との直接的な薬物傷害相互作用の機会を提供し、MAO-B による MPTP の有毒代謝物 MPP+ への代謝が減少し、ニューロンへの MPP+ の取り込みが減少しました。 DAT 経由、または神経炎症の軽減。我々の現在の研究では、マウスにおけるクレンブテロールの急性投与がDATのわずかな減少と関連していることを観察しました。これは、クレンブテロールを介した DAT レベルおよび/または機能の低下が MPP+ の取り込みを妨げ、それによって初期の MPTP 毒性を低下させ、疑似神経保護効果をもたらした可能性を高めます。

MPTP は黒質線条体経路の選択的変性を引き起こしますが、堅牢な α-syn 病理は引き起こしません 49,50。このモデルには病理学的 α-syn 封入体が存在しないことは、クレンブテロールを介した病理学的 α-syn の減少が、MPTP モデルで報告されている神経保護のメカニズムではない可能性が高いことを示唆しています 37。トランスジェニックα-synヌルマウスは、急性および慢性のMPTP誘発毒性に耐性があることが注目されており 51 、MPTPモデルにおける神経保護におけるα-synの喪失に関係している可能性がある。しかし、ミトコンドリア複合体 I 阻害剤であるロテノンに対する耐性は、α-syn ヌル胎児中脳ニューロンでは観察されません 51。これらのいくぶん矛盾した結果は、発生中のα-synの喪失に関連する代償性遺伝子変化28が、α-synの喪失そのものではなく、α-synヌルマウスにおけるMPTPからの神経保護に関与している可能性を提起する。

PD疾患の改善に効果があるためには、β2ARアゴニストの慢性投与が必要であると予想するのは合理的である。本研究では、ラットにおける Snca mRNA の有意な減少は、単一のクレンブテロール注射パラダイムでのみ観察されました。さらに、ラットの最高用量（40 mg/kg）では、mRNA の変化は観察されず、急性クレンブテロールの逆 U 字型用量効果曲線が示唆されました。 1 週間にわたる複数回の注射後でも Snca mRNA の減少は検出されず、クレンブテロールに関連するタキフィラキシーが示唆されました。反復投与後のクレンブテロールレベルの減少により、持続的なβ2ARアゴニズムがα-synタンパク質を減少させることができるかどうかを判断することが困難になる。タキフィラキシーの影響を受けない別の β2AR アゴニストが α-syn を減少させる可能性があります。上で紹介したように、β2AR の長期刺激は受容体の脱感作、内部移行、およびダウンレギュレーションを引き起こす可能性があります。 0.5 mg/kg という低用量のクレンブテロールを 1 日 2 回、4 ～ 7 日間投与すると、皮質 β2AR の機能的脱感作を引き起こすことが示されています 52。 0.3 mg/kg を 1 日 2 回で 14 日間、0.25 mg/kg を 1 日 1 回で 10 日間という低用量では、それぞれラットの大動脈と子宮で受容体脱感作が引き起こされました 53,54。本研究ではβ2ARリン酸化またはその存在量の減少を観察することはできなかったが、クレンブテロールの反復投与後に機能的β2AR脱感作が起こる可能性は依然として残っている。これは、単回投与がα-syn mRNAの減少と関連するのに、反復投与パラダイムでは関連しない理由についての考えられる説明を提供する。単回投与パラダイムと複数回投与パラダイムで観察されるα-syn mRNA に対する異なる効果のもう 1 つの可能性は、クレンブテロールの反復投与がそれ自体の代謝を促進することです。実際、脳と血漿の両方で、単回注射と比較して、複数回注射パラダイム後のクレンブテロールのレベルが低いことが観察されました。クレンブテロールはシトクロム P450 酵素 CYP1a1 および CYP1a255 の基質であり、ニワトリにクレンブテロールを投与すると肝臓ミクロソームのシトクロム P45056 が上昇します。総合すると、単回投与パラダイムで観察された Snca mRNA 減少の一過性の性質と、β2AR アゴニストクレンブテロールによって誘発されるどのパラダイムでも α-syn タンパク質の減少が検出できないことを組み合わせると、β2AR アゴニストが長期的な利益をもたらすかどうかという疑問が生じます。 PDのリスク軽減または疾患修飾療法。

考慮すべきもう 1 つの概念は、β2AR アゴニストの有効量と毒性量です。マウスでは、α-syn を減少させるには 10 mg/kg のクレンブテロールが必要であると報告されており、注射後 24 時間までに脳組織内にクレンブテロールが約 20 ng/g になります 37。クレンブテロールは人間への使用が FDA によって承認されていませんが、減量や筋肉成長のための市販サプリメントとしてよく摂取されています。ヒトの場合、摂取される用量は20～100マイクログラム程度で、これらの用量では場合によっては頻脈、胸痛、動悸、振戦、心筋虚血などの副作用が報告されています57、58、59、60。げっ歯類モデルでは、慢性的なクレンブテロールが心筋組織に損傷を与える可能性があります61,62。比較的低用量に伴うこれらの潜在的な有害な副作用は、クレンブテロールの治療可能性を制限する可能性があります。マウスでα-synを減少させるために必要と報告されているレベルと同等の脳レベルを得ることが目標である場合、他の長時間作用型β2ARアゴニストの使用にも同様の注意が推奨されるであろう。

私たちの現在の研究は、特にα-synタンパク質に対するクレンブテロールの効果に焦点を当てましたが、β2ARアゴニストが他のメカニズムを介してPDに神経保護および/または症状上の利益をもたらす可能性を排除することはできません。 β2AR アゴニストは、動物モデルにおいて、大きな中性アミノ酸系を介した輸送を増加させ、ドーパミン合成のための L-チロシンおよび血液脳関門を通過するレボドーパの輸送を増加させることが示されています 63,64,65,66,67,68。喘息に一般的に使用される β2AR アゴニストであるアルブテロールは、レボドパの補助療法として使用すると、一部の PD 運動症状の改善につながることが報告されています 63,64。さらに、β2AR アゴニストには、神経保護に関連する抗炎症特性があることが示されています。ロテノン 69 に応答したイオン化カルシウム結合アダプター分子 1 (IBA1) および分化分子 68 の貪食マーカークラスター (CD68) 陽性ミクログリアの減少、誘導性一酸化窒素合成酵素 (iNOS) および分化分子 11B クラスター (CD11b) の mRNA 発現の減少カイニン酸に反応した海馬70、ミクログリア増殖の抑制71、リポ多糖類（LPS）に反応した腫瘍壊死因子α（TNF-α）とインターロイキン6（IL-6）の減少72,73、TNF-αと一酸化窒素の減少ミクログリアと LPS による神経保護はすべて報告されています 48。 β2AR アゴニストは、神経成長因子や脳由来神経栄養因子などの神経栄養因子を増加させることも示されています 70、74、75。 PD のモデルに加えて、β2AR アゴニストは、虚血性脳卒中 76 および興奮毒性 70 の前臨床モデルにおいて神経保護作用があり、APP/PS1 トランスジェニックマウスアルツハイマーモデルにおいて神経新生、樹状突起分岐を促進し、脳アミロイド斑を減少させ、運動上の利点をもたらすことが報告されています。 SOD1G93A トランスジェニック ALS マウスモデル 77。

結論として、我々の現在の in vivo 結果は 2 つの種について、また 2 つの別々の研究室で実施された in vitro 結果は、α-syn を減少させるクレンブテロールの能力は一時的であり、α-syn mRNA のわずかな減少に限定されているが、タンパク質の減少には限定されていないことを実証している。我々の結果は、おそらくβ2AR受容体の脱感作および/または薬物代謝の増加により、これらの最小限の効果は繰り返し投与すると失われることを示しています。これらの発見に基づいて、我々は、β2AR アゴニストであるクレンブテロール自体には、PD の疾患修飾戦略として α-syn を低下させる可能性はないと結論付けています。

生後 3 か月の雄の Fischer 344 ラット (n = 90) を Charles River Laboratories から購入しました。 8 週齢の雄 C57BL/6 J マウス (n = 40) を Jackson Laboratory から購入しました。 12時間の明暗サイクルのある部屋に、ラットをケージあたり1～3匹、マウスをケージあたり5匹ずつ飼育し、餌と水を自由に与えました。すべての動物実験は、ミシガン州立大学グランドラピッズミシガン州研究センターの動物実験室で行われました。すべての手順は、ミシガン州立大学のミシガン州立大学動物管理使用委員会 (IACUC) に従って承認され、実施されました。

クレンブテロール HCl (Sigma-Aldrich C5423; Lot# BCBQ2163V) 粉末は、使用するまで 4 °C で保管されました。注射の約 30 ～ 60 分前に、クレンブテロールを遊離塩基ベースで 5 mg/mL の濃度になるまで滅菌 0.9% 生理食塩水で希釈し、完全に溶液になるまでボルテックスしました。動物の体重を測定し、その後、体重に基づいて適切な量の溶液を腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）注射して、１０、２０、または４０ｍｇ／ｋｇのクレンブテロールを送達した。ビヒクル対照群には、種：マウス（１０ｍｇ／ｋｇ）またはラット（４０ｍｇ／ｋｇ）に送達される最大量に等しい量の０．９重量％の生理食塩水を摂取させた。複数回投与の研究では、約 30 時間の半減期 41 を利用して、注射は 1 日おきに行われ、クレンブテロールの存在レベルを常に維持しました。すべての体重測定と注射は午前中に行われ、最後の注射の翌日に動物を安楽死させ、組織/血漿を収集しました。

動物はペントバルビタール（Beuthanasia-D Special、Merck Animal Health）の過剰摂取（30 mg/kg）で安楽死させた。ＣＳＦを収集するために、蝶の頭皮静脈セット（ＥｘｅｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２６７０８）を保持するように改造された定位装置にラットを固定した。針を大槽に下げ、CSFを抽出し、氷上で短期間保管した。 CSF を遠心分離（10,000 × g、4 °C で 10 分間）して微量の血液を除去し、-80 °C で保存しました。血漿を収集するために、ヘパリン添加シリンジで心臓血液を抽出し、BD Vacutainer™ 採血管 (BD 367862) に移し、反転して混合し、サンプルが処理できるまで氷上に保管しました。血液を遠心分離し（3,000 RPM、4℃で5分間）、血漿を収集し、-80℃で保存しました。心臓血液の採取直後に、結果を複雑にする可能性がある脳から血液を除去するために、氷冷ヘパリン加生理食塩水（0.9%）をラットの心臓内に、マウスに経心臓的に灌流した。脳を取り出し、ドライアイス上の2-メチルブタン中で急速冷凍し、-80℃で保存した。脳を-15℃のクライオスタット上に載せて関心領域に切片化し、次に関心領域（線条体、黒質、海馬）を顕微解剖して微量遠心管に収集した。ウェスタンブロット、ELISA、および質量分析のために収集された組織は、ドライアイス上に保管され、その後 -80 °C で保管されました。液滴デジタル PCR (ddPCR) 用に収集した組織を、100 μL TRIzol 試薬 (Invitrogen 26696026) を含む DNase/RNase フリー微量遠心管に加え、使い捨て乳棒でホモジナイズし、TRIzol 試薬の体積を 1 mL にし、ピペッティングで混合し、凍結させました。ドライアイスで保存し、-80 °C で保存します。

TRIzol 中のサンプルを氷上で解凍し、簡単に遠心分離してチューブの底にあるすべての液体を収集しました。 Phasemaker 微量遠心管 (Invitrogen、A33248) を 16,000 × g で 30 秒間遠心分離することによって準備しました。各サンプルを Phasemaker チューブに移し、室温で 5 分間インキュベートした後、200 μL のクロロホルムを加えました。チューブを手で振り、室温で 10 分間インキュベートし、16,000 × g、4 °C で 5 分間遠心分離しました。水相 (透明な液体) を RNase フリーのチューブに移し、等量の 100% エタノールを加え、サンプルを簡単にボルテックスしました。カラムベースの核酸精製キット (Zymo Research、R1016) を使用して、メーカーの指示を変更した方法でサンプルをさらに処理しました。サンプルを一度に 600 μL ずつカラムに添加し、12,000 × g で 1 分間遠心分離しました。これをサンプル全体が使用されるまで繰り返しました。すべての RNA 洗浄/調製バッファーのステップは、バッファーをカラムに添加し、12,000 × g で 1 分間遠心分離することによって実行されました。サンプルをカラムにロードした後、サンプルを 400 μL の RNA 洗浄バッファーで洗浄しました。 1X DNase I カクテル (Thermo Scientific FEREN0521 の DNase I; Thermo Scientific FERB43 の MgCl2 を含む反応緩衝液) をカラムに添加し、室温で 15 分間インキュベートしました。 DNase I カクテルをカラムに通して遠心分離した後、400 μL の RNA prep バッファーを加え、カラムに通しました。カラムを RNA 洗浄バッファーで 2 回、それぞれ 700 μL、次に 400 μL で洗浄し、12,000 × g で 2 分間乾燥させました。 DNase/RNase フリー水 (15 μL) を加え、カラムを室温で 1 分間インキュベートし、遠心分離 (10,000 × g で 1 分間) によって RNA を溶出しました。 RNA の質と量は、Agilent RNA 6000 Pico Kit (5067-1513) を使用した Agilent 2100 Bioanalyzer で評価されました。 RNA を -80 °C で保存する前に、RNA を DNase/RNase フリー水で 1 ng/μL に希釈し、等分しました。

RNA を解凍し、2 ng を iScript Reverse Transcription Supermix とともに cDNA 合成に使用しました (Bio-Rad、1708841)。 cDNA合成は、以下の設定でサーモサイクラーで実行しました：25℃で5分間、46℃で20分間、95℃で1分間、4℃で保持（蓋の温度は105℃で一定）。 -20℃での保存が必要な場合には、すべてのcDNAを2X cDNA保存バッファー（等量の10 mM Tris HCl（pH 7.5）と0.1 mM EDTA pH（8.0））で希釈しました。液滴デジタル PCR (ddPCR) 用のサンプルを調製するために、必要に応じて cDNA を氷上で解凍し、2X ddPCR Supermix for Probes (Bio-Rad、186-3026) と 20X Taqman プライマープローブセットを含むマスターミックスを作成しました。マウスに使用したプローブは Snca (Applied Biosystems #4331182、Mm01188700_m1、FAM-MGB) でした。および 2 つの異なる参照プローブ、Gapdh (Applied Biosystems #4331182、Mm99999915_g1、VIC-MGB)、および Rpl13 (Applied Biosystems #4331182、Mm02342646_g1、VIC-MGB)。 Rpl13に対して正規化された結果は補足図8に示されています。ラットに使用したプローブはSnca（Applied Biosystems #4331182、Rn00569821_m1、FAM-MGB）であり、参照プローブはGapdh（Applied Biosystems #4331182、Rn01749022_g1、VIC-MGB）でした。使用したすべての Taqman プライマープローブセットでは、プローブはエクソン-エクソン接合部にまたがっていました。等量の cDNA とマスターミックスをチューブに加え、混合し、簡単に遠心分離し、20 μL を DG8 液滴発生器カートリッジ (Bio-Rad、1864008) のサンプルウェルに加えました。カートリッジの油井に、70 μL の液滴生成オイル (Bio-Rad、1863005) を添加しました。ゴム製ガスケット (Bio-Rad、1863009) をカートリッジ上に固定し、QX 液滴生成器 (Bio-Rad、186-4002) を使用して RNA 含有液滴を生成しました。カートリッジの液滴ウェルから、40 μL の液滴を 96 ウェルプレート (Bio-Rad、12001925) に移します。すべてのサンプルを移した後、プレートシーラー (Bio-Rad、181-4000) により穿刺可能なホイル (Bio-Rad、181-4040) でプレートをシールしました。プレートを以下の設定でサーモサイクラー (Bio-Rad、C1000) に移しました: 95 °C で 10 分間、39 サイクル (94 °C で 30 秒、60 °C で 1 分間)、98 °C で 10 分間、12 °C で保持します (蓋の温度は 105 °C で一定)。 PCR後、プレートをQX200液滴リーダー(Bio-Rad、1864003)に移し、結果をQuantaSoftソフトウェアで分析します。すべてのサンプルについて、対象の遺伝子は参照遺伝子に対して正規化されました。 Gapdh は、従来から使用されているハウスキーピング遺伝子およびタンパク質であり、ほとんどの組織で高く一貫した mRNA 発現を示すため、参照遺伝子の 1 つとして選択されました。関連遺伝子 Rpl13 が最初に Snca mRNA および α-syn タンパク質に対するクレンブテロールの効果を報告した Mittal et al.37 で使用されたため、追加の参照遺伝子 Rpl13a も使用しました。正規化に異なる参照遺伝子を使用しても、全体的な結果には影響しませんでした。

α-syn タンパク質を調べるためのサンプル調製は、Mittal et al.37 で行われた最初の弱い溶解ステップと、残りのペレットに対する 2 番目の強力な溶解ステップの 2 つのステップで実行されました。 -80 °C、100 μL および 200 μL の弱溶解バッファー (320 mM スクロース、5 mM NaF、1 mM Na3VO4、10 mM Tris (pH 7.4)、1 mM EGTA、1 mM EDTA) から取り出した凍結組織パンチをSN と線条体にそれぞれ追加されます。組織を使い捨て乳棒でホモジナイズし、氷上で 10 分間インキュベートし、10,000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離しました。上清を新しいチューブに移し、再度 10,000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離し、上清を収集しました。ペレットがあったとしても小さなペレットのみが残っています。元の量の弱溶解バッファーに等しいRIPA溶解バッファー(Santa Cruz Biotechnology、sc-24948)を、弱溶解画分の最初の遠心分離から残ったペレットに添加した。 RIPA バッファー中のペレットを、プローブソニケーター (Qsonica Q125)、直径 2 mm のプローブ (QSonica. 4423)、振幅を 30% に設定した 1 秒パルスの 2 ～ 4 回のバーストでホモジナイズしました。 RIPA バッファー中のサンプルを 4 °C、10,000 × g で 10 分間遠心分離し、上清を収集しましたが、ペレットはほとんどまたはまったく存在しませんでした。ビシンコニン酸 (BCA) アッセイ (Fisher、23223、ビシンコニン酸; Fisher、23224、硫酸銅) を使用して、-80 °C で保存する前に弱および強 (RIPA) 溶解緩衝液画分中のタンパク質量を推定しました。

3X サンプルバッファーを作成し (140 μl 50% グリセロール/0.1 ブロモフェノールブルー、40 μl 10% SDS、および 20 μl ベータメルカプトエタノール)、各サンプルのタンパク質 5 ～ 10 μg に添加しました。サンプルを 100 °C で 5 分間インキュベートし、氷上で冷却し、軽く混合して遠心分離し、ランニングバッファー (3.03% Trizma ベース、 14.4% グリシン、1% SDS)。組換えタンパク質マーカーの範囲 (2 ～ 250 kD) には、α-syn が存在すると予測される 14 kD 付近のマーカーが含まれていたため、Precision Plus Protein Dual Xtra ラダー (Bio-Rad、161-0377) を使用しました。ゲルを定電圧で動作させ、90 V で開始して 45 分間、次に色素フロントがゲルからほとんど流れ出すまで 130 V で動作させました。ゲルの泳動が終了する前に、膜を転写用に準備しました。 α-syn ブロットの場合、0.45 µm ニトロセルロースメンブレン (Bio-Rad、1620167) とブロット紙 (Bio-Rad、1620118) をトランスファーバッファー (3.03% Trizma 塩基、14.4% グリシン、20%) に少なくとも 5 分間浸しました。メタノール）。他のすべてのタンパク質については、Immobileon-FL メンブレン (Millipore、IPFL00010) を 100% メタノール中で 30 秒間活性化し、次にニトロセルロースメンブレンの代わりにトランスファーバッファーに浸しました。湿式転写を定電流 400 mA で 45 分間実行しました。転写が完了した直後に膜を除去し、α-syn ブロットの場合のみ、1X トリス緩衝食塩水 (TBS) (pH 7.4) 中の 0.4% パラホルムアルデヒドで 30 分間固定しました。膜をTBSで5分間×2回洗浄した。膜を Revert Protein Dye (LI-COR 926-11021) 中で 5 分間インキュベートし、6.7% 氷酢酸と 30% メタノールの溶液で 2 × 30 秒洗浄し、ddH2O ですすぎ、LI 上で 700 nm で画像化しました。 -COR Odyssey CLx の総タンパク質。膜を除去し、TBSで5分間×2回洗浄し、1:1 TBS-Tween (0.1%):StaringBlock T20ブロッキングバッファー(Thermo Scientific、37543)中で1時間ブロックした。メンブレンを、1:1 TBS-Tween (0.1%):StaringBlock T20 ブロッキングバッファー中の一次抗体中で 4 °C で一晩インキュベートしました。使用した一次抗体は次のとおりです: 1:1,000 ウサギ抗 α-syn (Abcam、ab212184、ロット番号 GR3185934)、1:500 マウス抗 α-syn (Millipore、MABN1817、ロット番号 3099686)、1:500 ラット抗 DAT (Millipore、MAB369、ロット番号 3258730)、1:1,000 ウサギ抗 DAT (Sigma-Aldrich、D6944、ロット番号 087M4786V)、1:1,000 ウサギ抗 β2AR (Invitrogen、MA5-32570、ロット番号 UH2832117)、1:セリン 355 でリン酸化された 500 個のウサギ抗 β2AR (Invitrogen、PA5-38403、ロット番号 UI2847382)、およびセリン 346 でリン酸化された 1:500 ウサギ抗 β2AR (Invitrogen、PA5-36784、ロット番号 UH2832047)。膜をTBS-Tween (0.1%)で5分間×3回洗浄し、二次抗体中で暗所、RTで1時間インキュベートしました。使用した二次抗体は次のとおりです: 1:15,000 ロバ抗ウサギ IRDye 800CW (LI-COR、926-32213、ロット番号 C60322-03)、1:15,000 ヤギ抗マウス IRDye 800CW (LI-COR、926-32210、ロット番号) C20808-02)、または 1:15,000 ヤギ抗ネズミ IRDye 800CW (LI-COR、926-32219、ロット番号 C90813-13)。膜を暗所に保管し、TBS-Tween (0.1%) で 5 分間× 3 回、TBS で 5 分間× 1 回洗浄し、LI-COR Odyssey CLx で目的のタンパク質を画像化しました。バンド濃度測定は、LI-COR Image Studio Lite (バージョン 5.2) を使用して実行されました。総タンパク質染色および対応するターゲットバンドの周囲にボックスを描いて、各レーンの総タンパク質シグナルとターゲットバンドシグナルを取得しました。各総タンパク質染色レーンからのシグナルを最も高い総タンパク質染色レーンのシグナルで割って、各レーンのレーン正規化係数を計算しました。各サンプルの正規化信号は、ターゲットバンド信号を対応するレーン正規化係数で割ることによって計算されました。ウェスタンブロットからの代表的な全長レーン（総タンパク質ローディングコントロールおよび標的タンパク質）の例を補足図に示します。 9と10。

ELISAは、製造業者の指示に従って、既製の比色マウスα-synサンドイッチELISAキット(LS Bio、LS-F6284-1)を使用して実施した。サンプルをサンプル希釈液で SN については 1:20、線条体については 1:20、血漿については 1:25 に希釈しました。標準とサンプルは 2 回実行されました。 SN および線条体からの残りの希釈サンプルを使用して BCA アッセイを実行し、結果をタンパク質に対して正規化するために使用しました。 450 nm での吸光度を Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader で読み取りました。

厚さ 40 マイクロメートルの冠状脳組織切片を、Triton X-100 を含む TBS (TBS-TX) で洗浄し、RNAscope Pretreatment Kit (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA; 322330) の過酸化水素中で 1 時間インキュベートしました。切片をTBSで洗浄し、次にVistaVision HistoBondスライド(VWR、Randor、PA; 16004-406)に載せ、60℃のスライド加温器上に一晩置いた。次に、スライドを ACD Biosciences ターゲット検索バッファー中で 99 °C で 10 分間インキュベートし、水で 2 回洗浄しました。組織の輪郭を Pap Pen (Abcam、ケンブリッジ、英国、ab2601) で輪郭を描き、ハイブリダイゼーションオーブン内で ACD プロテアーゼプラスとともに 40 °C で 15 分間インキュベートし、水で 2 回洗浄し、ラット Adrb2 のプローブ (カタログ番号: ４６８１３１、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｅｌｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ；４５７７３１）を４０℃のハイブリダイゼーションオーブン内で２時間洗浄し、続いてＡＣＤ洗浄緩衝液で洗浄した。次に、メーカーの指示に従い、ハイブリダイゼーションオーブン内で、増幅バッファー（Advanced Cell Diagnostics、カリフォルニア州ヘイワード、322300）を使用した 6 つの増幅ステップを、30 分と 15 分のインキュベーション間隔で交互に実行しました。付属の DAB 試薬を使用して組織を発色させ、TBS-TX で洗浄し、上昇エタノール洗浄を経て、キシレンで洗浄しました。スライドにCytoseal 60でカバースリップをかけ、QICAMカメラ（QImaging、サリー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）を備えたNikon Eclipse 90i顕微鏡で画像化した。

すべての溶媒は LC-MS グレードのもので、Fisher Scientific から購入しました。他のすべての化学物質は Sigma-Aldrich から購入しました。スピンフィルターは Millipore Sigma から購入しました。サンプルごとに 100 μL のラット血漿と 50 μL のマウス血漿を使用しました。血漿を4:1の氷冷アセトンを用いて-20℃で一晩沈殿させた。遠心分離 (18,000 × g、2 分間) 後、上清を除去し、完全に乾燥させました (真空遠心分離機を使用して 30 °C)。サンプルを 300 μL の 0.1% ギ酸に再懸濁しました。不溶性粒子は、カットオフ 3 kDa のスピンフィルターを使用して濾過して除去しました。フロースルーを完全に乾燥させ、2.5 ng/mLの重クレンブテロール-d9を含む20 μLの0.1% ギ酸、2% ACNに再懸濁した。検量線は、5 匹の動物 (ラットまたはマウス) からの未処理血漿を混合し、混合血漿に 0.06、0.2、0.6、2.0、6.0、20.0、60.0、および 200.0 ng/mL の濃度のクレンブテロールをスパイクすることによって作成しました。すべての実験は、Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 UHPLC システムを備えた Thermo Scientific™ Q Exactive™ HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 質量分析計で行われました。各分析は、2 μl のサンプル注入による 3 回の 15 分間の逆相グラジエントで構成されます。分離には 15 cm C18 EasySpray カラムを使用します。サンプルは、クロマトグラフィーによる分離の前にオンライン脱塩のために 5 mm C18 トラップカートリッジにロードされます。サンプルは三重に取得されました。

質量分析分析では、クレンブテロール (277.08690 m/z) および重クレンブテロール (286.14339 m/z) を単離および断片化するために PRM スキャンモードを利用しました。フラグメント質量スペクトルは、15,000 分解能 (200 m/z)、AGC 2e5、最大注入時間 100 ms で取得されました。ペプチドは段階的衝突 NCE 25、50 および 1.3 m/z の分離ウィンドウで断片化されました。エレクトロスプレー電圧は１．９ｋＶであった。ピークの選択と面積の計算は、Skyline バージョン 4.2 によって実行されました。すべてのピークは手動で検証されます。クレンブテロールフラグメントの合計ピーク面積 203.01373 m/z、168.044877 m/z、および 132.068199 m/z を、重クレンブテロールフラグメントの合計ピーク面積 204.020006 m/z、169.051154 m/z、および 133.074476 m/z に正規化して使用します。定量用。

すべての溶媒は LC-MS グレードで、Fisher Scientific から購入しました。他のすべての化学物質は Sigma-Aldrich から購入しました。スピンフィルターは Millipore Sigma から購入しました。 5 ～ 10 mg の脳組織パンチを「結合」画分と「非結合」画分に隔離しました。「結合」画分は、β2AR との相互作用など、タンパク質に結合したクレンブテロールを表します。各サンプルの「合計」、「非結合」、および「結合」画分の調製は次のとおりです。すべての操作は氷上で行われました。２００μＬの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＭＢＩＣ）、ｐＨ８中で１０秒間の超音波処理によりサンプルを溶解した。「総」クレンブテロールの代表として１０μＬの上清を除去し、保管した。サンプルを遠心分離しました (18 K × G、10 分間)。残った上清をリンスせずにスピンろ過しました (3 kDa 18 K × G、10 分間)。フロースルーを「非結合」画分として収集した。フィルター上に保持された物質を、反転スピン (18 K × G、2 分) によって「結合」画分として収集しました。ペレット化した脳物質を 200 μL の 60% ACN、30% MeOH、10% 25 mM AMBIC、pH 8 で抽出し、10 秒間超音波処理し、遠心分離しました (18 K × G、10 分)。上清を除去し、「結合」画分と合わせた。「合計」、「非結合」、および「結合」画分からのタンパク質を、5:1 の氷冷アセトンを用いて -20 °C で一晩沈殿させました。遠心分離 (18 K × G、10 分間) 後、上清を除去し、完全に乾燥させました (真空遠心分離機を使用して 30 °C)。「非結合」画分を、２．５ｎｇ／ｍＬの重クレンブテロール－ｄ９を含む２０μＬの０．１％ＦＡ、２％ＡＣＮ中に再懸濁した。「結合」画分を、２．５ｎｇ／ｍＬの重クレンブテロール－ｄ９を含む２０μＬの０．１％ＦＡ、２％ＡＣＮ中に再懸濁した。１８０μＬの０．１％ＦＡを添加し、スピン濾過し、完全に乾燥させ、２０μＬの０．１％ＦＡ、２％ＡＣＮ中に再懸濁した。

「全」画分を２００μＬの０．１％ギ酸に再懸濁し、スピン濾過し、完全に乾燥させ、２．５ｎｇ／ｍＬの重クレンブテロール−ｄ９を含む２０μＬの０．１％ＦＡ、２％ＡＣＮに再懸濁した。「非結合」および「結合」検量線は、10 匹のマウスからの 10 mg の未処理脳組織を組み合わせ、2 mL の緩衝液中で超音波処理し、ライセートを 10 個のサンプルに等分し、各アリコートから 10 μL を除去することによって作成しました。アリコートを、上記のようにスピン濾過によって「非結合」画分と「結合」画分に分離した。次に、各画分にクレンブテロールを 0.3、1.0、3.0、10.0、30.0、100.0、300.0 pg、1.0、3.0、および 10.0 ng の濃度でスパイクしました。クレンブテロールを上記のように抽出した。

「合計」検量線は、8 匹のマウスの未処理脳組織 10 mg を組み合わせ、1.6 mL の緩衝液中で超音波処理し、ライセートを 8 つのサンプルに等分し、3.0、10.0、30.0、100.0、300.0 pg の濃度でクレンブテロールをスパイクすることによって作成されました。 1.0、3.0、10.0 ng。

統計分析は GraphPad Prism バージョン 7.03 を使用して実行され、すべてのケースの有意性は α ≤ 0.05 を使用して実行されました。外れ値は、中央値法からの絶対偏差を使用して評価され78、中央値絶対偏差の 2.5 倍という「非常に保守的な」差が除外基準として使用されました。 2 つのグループ (つまり、生理食塩水対照とクレンブテロール) による実験は、両側 t 検定を使用して分析されました。単一時点での複数のグループを用いた実験 (すなわち、生理食塩水対照、10、20、および 40 mg/kg クレンブテロール) を、一元配置 ANOVA および多重比較のための事後 Tukey 検定で分析しました。 1日および1週間の時点での複数のグループによる実験は、多重比較のために二元配置分散分析および事後テューキー検定を使用して分析されました。体重変化の分析は、二元配置反復測定分散分析と、多重比較のための事後シダックテスト (マウス) またはテューキーテスト (ラット) を使用して実行されました。すべてのグループ平均、標準誤差、およびすべての結果の統計検定情報は、補足統計文書に記載されています。

Sprague-Dawley E18初代ラット皮質ニューロンを、ポリ-D-リジンでコーティングした96ウェルプレートにウェルあたり50K細胞でプレーティングした。 DIV11 では、DMSO ビヒクルまたはクレンブテロール (最終ウェル濃度 1、5、10、または 20 μM) を添加しました。 2日後、DIV 13で細胞をPBSで洗浄し、0.1%β-メルカプトエタノールを含むRLT Plus緩衝液175μLを各ウェルに添加した。サンプルごとに 2 つのウェルを組み合わせた後、QiaCube と組み合わせた Qiagen RNeasy Plus Mini Kit を製造元の指示に従って RNA 抽出しました。 cDNA 合成では、16 μL の RNA を 4 μL の 5x iScript RT Supermix (Bio-Rad) に加え、サーモサイクラーに置きました (25 °C で 5 分間、42 °C で 30 分間、85 °C で 1 分間、 4℃に保ちます）。マルチプレックス TaqMan RT-qPCR を使用して、ROX 参照色素を使用した 10 uL の反応容量における相対的な遺伝子発現を定量しました。カスタムラット Snca (フォワード: CTGTACCTGCCCCTCAGCAT; リバース: AGCCTGCTACCATGTATTCACTGTAG; プローブ: CGGTGCTCCCCTCT) および市販の Xpnpep1 (Applied Biosystems Rn00590960_m1) プライマー/プローブセットを使用しました。 Snca の増幅は Xpnpep1 の増幅に対して正規化されました。変化倍数の値は、ΔΔCt 法と薬物処理サンプルと対照処理サンプルの比を使用して計算しました。データは Thermo Fisher Connect クラウド Web ツールと Microsoft Excel を使用して分析されました。 CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイ(Promega)を製造業者の指示に従って使用して、治療の毒性を評価した。

C57BL/6 J マウス (n = 24: 生理食塩水 10 匹とクレンブテロール 14 匹) に、10 mg/kg のクレンブテロールまたは等量の生理食塩水対照を 1 回腹腔内注射しました。投与の24時間後に動物を安楽死させ、脳を摘出し、液体窒素中で急速冷凍した。脳をクライオスタット上で切片化し、SNの凍結パンチを収集した。組織パンチを、Omni Bead Disruptor を使用して QIAzol 中で均質化しました (45 秒間オン、30 秒間オフ、45 秒間オン)。室温で５分後、２００μＬのクロロホルムを加え、サンプルを１５秒間ボルテックスした。室温で 3 分後、サンプルを 4 °C、12,000 rpm で 15 分間遠心分離しました。得られた水層４００μＬを等量の７０％エタノールと混合し、続いてＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用してＲＮＡを抽出した。 SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher) を使用して、300 ng RNA の逆転写を 20 uL の反応容量で実行しました。この反応容量を水で１：２に希釈した後、５μＬのＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３６９０１６）および０．２μＭの遺伝子特異的ＴａｑＭａｎアッセイを含む１０μＬのｑＰＣＲ反応液に２μＬをロードした。 Mittal ら 37 で使用したものと同一の TaqMan プライマー/プローブを Snca (Applied Biosystems Mm01188700_m1) に使用し、Rpl13a (Applied Biosystems Mm02342645_g1)、Actb (Applied Biosystems Mm00607939_s1)、または Ubc (Applied Biosystems Mm0) のいずれかに正規化しました。 1198158_m1) 。すべてのサンプルについて、対象の遺伝子は参照遺伝子または 3 つの参照遺伝子の幾何平均に対して正規化されました。 ActB と Ubc は、安定した発現、ハウスキーピング遺伝子として知られている用途、およびこの研究の基礎となった元のレポートでの以前の使用に基づいて選択されました 37。同様に、関連遺伝子 Rpl13 が以前のレポートで参照遺伝子の 1 つとして使用されたため、Rpl13a も使用されました 37。正規化に異なる参照遺伝子を使用しても、全体的な結果には影響しませんでした。メイン原稿に示されていないハウスキーピング遺伝子を使用した結果は、補足図8に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

すべての結果に関する統計検査情報は、補足統計文書に記載されています。この記事の調査結果を裏付けるデータは、責任著者からの合理的な要求に応じて入手できます。

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この研究は、マイケル J. フォックス財団パーキンソン病研究目標推進プログラムの支援を受けました。著者らはまた、このプロジェクトに対する更なる洞察と研究室間の議論の促進について、マイケル・J・フォックス・パーキンソン病研究財団のアンドリュー・コーメーター・コックス博士に感謝したいと思います。

米国ミシガン州グランドラピッズ、ミシガン州立大学トランスレーショナル神経科学学部

ジョセフ・R・パターソン、ジェイコブ・W・ハウ、アリソン・コール＝ストラウス、クリストファー・J・ケンプ、ミーガン・F・ダフィー、ジャレッド・ランプ、アンドリュー・アムステッド、マイケル・キュービック、アンナ・C・ストール、アーヴィング・E・ベガ、キャシー・スティース＝コリアー＆キャリルE. ソートウェル

神経変性疾患研究ユニット、バイオジェン、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

ウォーレン・D・ハースト、イー・チェン、アン・C・キャンベル、キャサリン・L・ネジッチ、ケリー・E・グリッチ

神経科学プログラム、ミシガン州立大学、イーストランシング、ミシガン州、米国

ジェイコブ・W・ハウ、ミーガン・F・ダフィー、マイケル・キュービック、キャリル・E・ソートウェル

米国ミシガン州アレンデール、グランドバレー州立大学細胞分子生物学部

クリストファー・P・ラッセル

米国ミシガン州イーストランシングのミシガン州立大学薬理学・毒物学部

アンナ・C・ストール

Mercy Health Hauenstein Neuroscience Medical Center、グランドラピッズ、ミシガン州、米国

キャリル・E・ソートウェル

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概念化: JRP、WDH、CES。調査: JRP、JWH、CPR、ACS、CJK、MFD、JL、AU、MK、ACS、IEV、KSC、YC、ACC、CLN、および KEG。原稿準備（初稿）：JRP、CES。原稿の準備 (レビューと編集): JRP、WDH、CES、JWH、CJK、MFD、JL、AU、MK、ACS、IEV、KSC、YC、ACC、CLN、および KEG。

ジョセフ・R・パターソンへの通信。

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転載と許可

パターソン、JR、ハースト、WD、ハウ、JW 他 β2-アドレナリン受容体アゴニストであるクレンブテロールは、α-シヌクレイン mRNA を一時的に減少させますが、タンパク質の長期的な減少は引き起こしません。 npjパーキンソン病 8、61 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41531-022-00322-x

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受信日: 2021 年 12 月 24 日

受理日: 2022 年 4 月 8 日

公開日: 2022 年 5 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41531-022-00322-x

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