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Nov 13, 2023

外因性ミトコンドリア移植は、心停止からの蘇生後の生存率と神経学的転帰を改善します

Quantità di farmaco BMC

BMC Medicine volume 21、記事番号: 56 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

ミトコンドリア移植 (MTx) は、心停止 (CA) 後の重度の虚血再灌流傷害を軽減する可能性を秘めた新興技術ですが、十分に理解されていません。 現在の知識の重大なギャップに対処するために、MTx が CA 蘇生後の転帰を改善できるという仮説を検証します。

この研究は、インビトロ研究とインビボ研究の両方で構成されています。 我々はまず、外因性ミトコンドリアの初代神経細胞培養物への移動をインビトロで調べた。 ドナーラットの脳および筋肉組織から抽出された外因性ミトコンドリアと、神経細胞内の内因性ミトコンドリアは、共培養前に別々に標識されました。 共培養から 24 時間後、顕微鏡を使用してミトコンドリアの転移を観察しました。 インビトロでのアデノシン三リン酸 (ATP) 含有量を、新たに単離したミトコンドリアと凍結解凍したミトコンドリアの間で評価し、生存に対するそれらの効果を比較しました。 私たちの主な研究は、ラットに 10 分間の窒息 CA とそれに続く蘇生を施した CA の in vivo ラット モデルでした。 蘇生が成功した時点で、ラットは、ビヒクル、凍結融解ミトコンドリア、または新鮮な生存可能なミトコンドリアの静脈内注射の 3 つのグループの 1 つにランダムに割り当てられました。 CA 後 72 時間の間、MTx の治療効果を生存率の比較によって評価しました。 CAの24時間後、レシピエント動物の重要な器官内に標識されたドナーミトコンドリアが残存していることを顕微鏡で視覚化した。

提供されたミトコンドリアは培養神経細胞に取り込まれることに成功した。 移入された外因性ミトコンドリアは、神経細胞内で内因性ミトコンドリアと共局在しました。 新鮮なミトコンドリアの ATP 含有量は、凍結解凍したミトコンドリアよりも約 4 倍高かった。 インビボ生存研究では、凍結融解ミトコンドリアではなく、新たに単離した機能的ミトコンドリアにより、72時間生存率が55%から91%に有意に増加しました(P = 0.048 vs.溶媒)。 生存に対する有益な効果は、動脈乳酸値と血糖値の急速な回復、脳微小循環、肺水腫、神経機能の改善と関連していました。 標識されたミトコンドリアは、CA の 24 時間後に、生き残ったラットの重要な器官の内部で観察されました。

蘇生直後にMTxを行うと、CA後のラットの生存率と神経学的回復が改善されました。 これらの結果は、CA後に現在失われている命を救うための新しい治療戦略としてMTxの開発を促進する将来の研究の基礎を提供する。

査読レポート

ミトコンドリア移植 (MTx) は、虚血および再灌流 (I/R) によって損傷した細胞の機能を改善する可能性のある新興技術です。 心停止（CA）中、虚血損傷により細胞のアデノシン三リン酸（ATP）が急速に枯渇し、フリーラジカルが生成され、ナトリウムとカルシウムのイオン制御が調節不全になります。 これらのメカニズムは、再灌流中に悪化する可能性のある追加のシグナル伝達カスケードを引き起こし、深刻なミトコンドリア機能不全と死につながる可能性があります[1、2、3、4]。 幸いなことに、損傷したミトコンドリアは、分裂、融合、マイトファジー、および最近報告された細胞間ミトコンドリア転移のメカニズムを通じて、自己修復と細胞保護を行うことができます[5、6]。 ミトコンドリアが細胞から細胞へ移動できるという発見は、健康なドナーミトコンドリアを損傷したミトコンドリアを持つ細胞に移植できる可能性を示唆しています[7、8、9]。

多くの研究により、心臓損傷 [10、11、12、13、14、15、16、17] および脳卒中 [6、18] の分野における MTx 後の転帰の改善が確認されています。 ミトコンドリアは、標的組織に直接注入されるか、単純な静脈内注入によって送達されてきました[18]。 しかし、ミトコンドリアがニューロン、心筋細胞、その他の臓器にどの程度取り込まれるかは不明です。 ドナーミトコンドリアが健康な（呼吸している）ミトコンドリアとして組織内にどのくらいの期間存続するのか、それとも単に短命の生物学的に活性なミトコンドリア粒子を提供するだけなのかは不明です。 さらに、CA後のI/R損傷におけるMTxは研究されていません。

CA は毎年米国で 500,000 人以上を悩ませています [19]。 CA は体中のすべての循環を停止させ、全身虚血を引き起こし、未治療のまま放置すると致命的となります。 CAに苦しむ患者の蘇生法と逮捕後の管理が進歩したにもかかわらず、死亡率は90%を超え、生存者の多くは長期にわたる神経障害と心血管合併症を示している[20、21、22]。 現時点では、これらの不良転帰を有意義に改善できる効果的な薬剤やその他の治療法はほとんどありません[23]。 CA は、他の虚血性緊急事態と同様に、依然として公衆衛生上の重大な課題です。

私たちの研究では、MTx が CA などの重度の虚血性損傷からの蘇生後の転帰を改善できるという仮説を検証しています。 我々は、MTx に関する 3 つの重要な疑問に焦点を当てます: (1) 脳または筋肉から抽出された外因性同種ミトコンドリアは、培養中の神経細胞に正常に侵入しますか? (2) CA 直後に送達される新鮮なミトコンドリアの静脈内注入は、動物モデルにおける生存率および I/R 損傷の他の生理学的指標を変化させますか? (3) 移植されたミトコンドリアは CA の 24 時間後も組織内に残りますか? 我々は、CAからの蘇生後の多臓器損傷と死亡率の軽減におけるMTxの役割をさらに評価するための基礎を提供する一連の実験研究を通じてこれらの疑問に答えます。

外因性ドナーミトコンドリアが培養下で成長するニューロンに取り込まれるかどうかを調べるために、ドナーラットの脳または筋肉組織から抽出した外因性ミトコンドリアを神経細胞培養物と共培養しました。 ドナーのミトコンドリアとレシピエントの神経細胞培養物は両方とも、雄の Sprague-Dawley ラット (12 週齢、Charles River Laboratories、米国マサチューセッツ州ウィルミントン) に由来しました。 神経細胞は、成人脳解離キット (Miltenyi Biotec, Inc.、米国マサチューセッツ州サマービル) を使用して単離されました。 細胞を、ポリ-d-リジン (0.1 mg/mL) でコーティングされたカバーガラス上に 1 × 105 細胞/cm2 の密度で播種しました。 細胞の内因性（天然）ミトコンドリアは、ミトコンドリア転移の 24 時間前に、メーカーの指示に従って MitoTracker 色素 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で個別に標識しました。 簡単に説明すると、細胞を、MitoTracker Green プローブ (300 nM) を含むあらかじめ温めた (37 °C) 染色溶液に懸濁し、適切な増殖条件下で標準培地中で 30 分間インキュベートしました。 染色後、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄し、新鮮な培地に再懸濁した。

ミトコンドリア転移を視覚化するために、内因性ミトコンドリアが緑色に染色された神経細胞（上記参照）を、提供された外因性ミトコンドリア（赤色）と標準培地中で24時間共培養し、LSM 880共焦点イメージングシステムを使用して細胞を観察しました（ Carl Zeiss Meditec AG、イエナ、ドイツ）。

細胞培養における MTx 実験の場合、ミトコンドリア分離バッファー [210 mM d-マンニトール、70 mM スクロース、5 mM HEPES、1 mM EGTA、および 0.5% (w/v) 脂肪酸フリー ウシ血清アルブミン (BSA) 中の脳組織] での MTx 実験の場合）、ＫＯＨでｐＨを７．２に調整した］をホモジナイザーで５００ｒｐｍで３０回ストロークして破砕し、その後、ホモジネートをスイングアウトローターで４℃、８００ｇで１０分間遠心分離した。 次に、上清を 12,000 g、4 °C で 10 分間遠心分離して、ミトコンドリアを含むペレットを作成しました。 上清を除去した後、ペレットをミトコンドリア単離バッファーで 2 回洗浄し、ペレットを MitoTracker Deep Red プローブ (300 nM) を含む PBS を含むあらかじめ温めた (37 °C) 染色溶液に再懸濁し、30 分間インキュベートしました。 染色液を除去した後、標識ミトコンドリアをＰＢＳで２回洗浄した。 ミトコンドリアは、ブラッドフォードアッセイ (Pierce、ロックフォード、イリノイ州、米国) を使用してタンパク質濃度を測定することによって定量化し、移植まで氷上に保管しました。 500μLの新鮮な予熱培地に再懸濁したミトコンドリア(0.01mg/mL、最終濃度)を、ミトコンドリア転移に直ちに使用した。

ラットの筋肉由来ミトコンドリアは、細胞培養における MTx 実験 (A) と、CA モデル プロトコールで以下に概説するように、生体内ラットへの注入によって使用されるドナー ミトコンドリアとして (B) の両方に使用されました。 ミトコンドリアは、以前に記載されているように、迅速ミトコンドリア単離法を使用してラットの健康な大胸筋組織の 6 mm 片から単離されました [24]。 自動ホモジナイザーとさまざまなろ過を使用するこの方法は、すべての手順が 30 分で完了するため、スピードが重要な臨床用途に開発されたもので、最近 McCully らによって報告されました。 [8、10、24]。 簡単に説明すると、6 mm 生検パンチを使用して筋肉を採取した直後に、組織を 4 °C の冷均質化バッファー [300 mM スクロース、10 mM K-HEPES、および 1 mM K-EGTA (pH 7.2)] 中で切り刻み、自動ホモジナイザー（gentleMACS dissociator、Miltenyi Biotec Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して均質化した。 次に、ホモジネートを氷上でサブチリシン A (Bacillus licheniformis 由来のプロテアーゼ、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) で 10 分間消化し、0.49% 脂肪酸を含まない BSA を含む消化されたホモジネートをろ過しました。使い捨て滅菌メッシュフィルターシリーズ。 濾液を9000 gで10分間、4℃で遠心分離し、最終ペレットを0.5 mLの冷呼吸緩衝液[250 mM スクロース、2 mM KH2PO4、10 mM MgCl2、20 mM K-HEPES (pH 7.2)]に再懸濁しました。 ）、０．５ｍＭ Ｋ－ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）］。 6 mm の生検組織サンプルを使用して得られたミトコンドリア粒子の収量は約 1 × 1010 ミトコンドリアであると報告されており、これは注入だけでなく、品質保証および品質管理評価にも十分なミトコンドリアを提供しました [8、10、24]。 以前の研究では、この方法を使用して骨格筋から単離されたミトコンドリアの生存能力と機能性が一貫して実証されています[10、16、24、25]。 単離されたミトコンドリアは、新鮮なドナー ミトコンドリアとして静脈内注入にすぐに使用されるか、凍結融解ミトコンドリアとして次に使用されるまで 2 週間以上 -80 °C で凍結保存されました。

ATP含有量は、発光アッセイキット（ATPlite、マサチューセッツ州パーキンエルマー）を使用して、（a）ネガティブコントロールとしての呼吸緩衝液、（b）凍結融解したミトコンドリア、および（c）新たに単離したミトコンドリア中で、メーカーの指示に従って測定しました。 調製したサンプルまたは呼吸緩衝液からのミトコンドリア粒子合計 10 μL を、白色の不透明な底の 96 ウェル プレートの各ウェルに添加しました。 発光を測定した後、ATP標準原液から得られた標準曲線を用いて各ウェル内のATP濃度を計算した。

ミトコンドリア膜電位 (ΔψM) は、MitoProbe™ JC1 (5',6,6'-テトラクロロ-1,1',3,3'-テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド) アッセイ キット (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) によって評価されました。 BD FAC Symphony フローサイトメーター (BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)。 JC1 は、ミトコンドリア内で電位依存性の蓄積 (J 凝集体) を示し、緑色 (~ 529 nm) から赤色 (~ 590 nm) への蛍光発光のシフトによって示されます。 したがって、ΔψM は赤色蛍光 J 凝集体の増加によって評価できます。 単離後、1 mLの呼吸緩衝液中のミトコンドリア懸濁液を、1 μLの50 mM シアン化カルボニル 3-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP、最終濃度50 μM）の存在下または非存在下で、10 μLの200 μM JC1（最終濃度2 μM）と混合した。 CCCP は、十分に確立されたミトコンドリア膜電位破壊物質です。 37℃で30分間インキュベートした後、懸濁液を4℃、9000gで10分間遠心分離した。 ペレットを１ｍＬのＰＢＳを添加することによって１回洗浄し、遠心分離した。 ペレットを500 μLの新鮮な呼吸バッファーに再懸濁しました。 未染色のサンプルまたはサイズ参照ビーズ (Spherotech, Inc.、イリノイ州レイクフォレスト) を使用して、適切なミトコンドリア サイズと電圧設定を確立しました。 JC1 Red 陽性イベントの取得は 100,000 件のイベントに対して実行されました。 JC1 Red 蛍光 J 凝集体のパーセンテージは、新たに単離したミトコンドリア、凍結融解ミトコンドリア、および最も低いΔψM 対照として膜電位かく乱物質 CCCP で処理した凍結融解ミトコンドリアのサブグループにおけるΔψM として測定されました。 未染色のミトコンドリアをネガティブコントロールとして使用しました。 データは FlowJo ソフトウェア (Tree Star、米国オレゴン州アシュランド) で分析されました。

この in vivo 研究では、成体雄の Sprague-Dawley ラット (400 ～ 545 g、12 ～ 16 週齢、Charles River Laboratories) を使用しました。 動物は、12:12 時間の明暗サイクルの下、餌と水を自由に摂取できるげっ歯類施設に収容されました。 ラットに 4% イソフルラン (等感覚; Butler-Schein AHS、ダブリン、オハイオ州、米国) による麻酔下で 14 ゲージのプラスチック カテーテル (Surflo; テルモ メディカル コーポレーション、米国ニュージャージー州サマセット) を挿管し、機械換気し、外科手術を行った。麻酔下（2％イソフルラン）で調製されました。 外科的処置の前に、手術部位をポビドンヨードで洗浄し、その後、ポビドン処理した無菌の自己粘着性の透明な外科用ブランケットで覆った。 すべての外科的処置は滅菌機器を使用して行われ、実験グループを知らされていない研究者によって実行されました。 実験中、呼気終末二酸化炭素は、呼吸数 (RR) と一回換気量 (TV) を調整することによって 40 ± 5 mmHg に維持されました。これらの設定は、RR および 3.5 の場合は 40/min から 50/min の範囲内で調整されました。テレビの5.0mLまで。 マイクロカテーテル（PE-50; Becton Dickinson、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）を左大腿動脈と左大腿静脈に挿入して、血圧を監視し、それぞれ薬剤とドナーミトコンドリアを注入しました。 ヘパリン (300 U) を大腿静脈に注射しました。 実験中、サーモスタット制御の加熱パッドと加熱ランプを使用して、食道の温度を 37.0 ± 0.5 °C に維持しました。 血圧および針プローブ心電図監視データは、パーソナル コンピュータ ベースのデータ収集システムを使用して記録および分析されました。

すべての動物研究は、当施設の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールを使用し、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。 以前に記載されたように[26、27]、若干の変更を加えて、ラットにCAおよび心肺蘇生を施した。 簡単に説明すると、窒息を誘発する前に、ラットに吸入 O2 の一部 (FIO2; 0.3) で機械換気を行い、外科的処置中は 2% イソフルランで麻酔を維持しました。 臭化ベクロニウム (2 mg/kg) の静脈内投与により窒息を誘発し、続いて人工呼吸器のスイッチを切り、イソフルランの中止を行った。 CAは平均動脈圧<20 mmHgとして定義されました。 窒息誘発の 10 分後、FIO2 1.0 で機械換気を再開し、実験グループを知らされていない 1 人の研究者によって手動胸骨圧迫が 300/分の速度で行われました。 胸骨圧迫を開始してから 30 秒後に、20 μg/kg のエピネフリンをボーラス投与し、蘇生が成功するまで胸骨圧迫を継続しました。蘇生は、10 秒間の平均動脈圧が > 60 mmHg となる上室調律の復帰と定義されました。 。 ラットは、蘇生後の最初の 10 分間は FIO2 1.0 で機械換気され、その後 FIO2 は 0.3 に低下し、続いて人工呼吸器から切り離され、CA 2 時間後に抜管されました。 動脈血圧、心電図記録、および食道の温度を 2 時間監視しました。 血液ガスおよび乳酸分析のための動脈血サンプルは、ベースラインと CA 後 15 分および 120 分に採取されました。 追加の変力剤は投与されなかった。 2 時間の回復期間の後、動物から人工呼吸器を外し、すべての血管カテーテルと気管チューブを取り外し、外科的傷を縫合しました。 その後、ラットを簡単に入手できる餌と水とともにケージに戻し、室温を 22 °C に制御したげっ歯類施設で観察しました。 回復期間中のすべての動物の切開による痛みを軽減するために、ブプレノルフィン XR (0.2 mL; 0.26 mg) を 1 回皮下注射しました。 CA後の生存時間は最長72時間記録された。

神経機能スコア（NFS）は、以前に報告された神経機能スコアリングシステム[27]を使用して、CAの24、48、および72時間後に盲検研究者によって評価されました。 このスコアでは、神経学的に正常な動物には 500 点のスコアが与えられ、死亡または脳死状態のラットには 0 点のスコアが与えられます。

心エコー検査を使用して、ベースラインおよび CA 2 時間後の左心室駆出率 (LVEF) を評価しました。 経胸壁閉胸心エコー検査は、12〜4 MHzのプローブ（S12-4セクターアレイトランスデューサー、フィリップス、アムステルダム、オランダ）を使用して1人の盲検研究者によって実施され、すべての測定値は3つの心周期にわたって平均されました。

肺の湿重量と乾燥重量の比 (W/D) を肺水腫形成の指標として使用しました。 CA 後 72 時間で左下葉を取り出し、取り出し直後に重量を測定し (湿重量)、37 °C のオーブンで 7 日間乾燥させた後に再度重量を測定しました (乾燥重量)。 肺 W/D は、乾燥重量に対する湿重量の比として計算されました。

CAを受けた動物は、動物が蘇生に成功した直後に投与される介入の3つのグループのうちの1つにブロックランダム化された：（a）0.49％BSAを含む呼吸緩衝液の注入（溶媒グループ; n = 11）、（b）注入機能しない凍結解凍ミトコンドリアの注入（凍結解凍ミト グループ; n = 11）、または（c）新鮮な生存可能なミトコンドリアの注入（新鮮ミト グループ; n = 11）。 凍結と解凍のプロセスは、ミトコンドリア外膜の完全性の広範な破壊につながり、膜間空間からのシトクロム c の損失を通じて電子伝達鎖の活性を抑制します [28]。 そのため、新たに単離したミトコンドリアを投与した動物に注入したのと同量のミトコンドリアタンパク質、脂質、DNA、RNA、その他の高分子を維持するために、追加の対照群として凍結解凍したミトコンドリアを使用しました。 これらの破壊された凍結融解ミトコンドリアには、同様の量の生体分子が含まれていますが、生存能力や呼吸能力はありません。

CA 蘇生および MTx の 72 時間後に採取した脳および脾臓組織に対して、メーカーの指示に従って RNA 単離、逆転写、およびリアルタイム PCR 分析を実行しました。 TRIzol 試薬 (Sigma-Aldrich、米国) を使用して全 RNA を抽出し、ezDNase 酵素を含む SuperScript IV VILO™ Master Mix (Thermo Fisher、米国) を使用して逆転写しました。 リアルタイム PCR は、LightCycle 480 システム (Roche Diagnostics) で TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher, USA) を使用して実行されました。 使用したプライマーは、ダイナミン関連タンパク質 1 (Drp1、Rn00586466_m1)、ミトコンドリア分裂 1 タンパク質 (Fis1、Rn01480911_m1)、視神経萎縮-1 (Opa1、Rn00592200_m1)、ミトフシン-1 (Mfn-1、Rn00594496_m1)、とミトフシン-2 (Mfn-2、Rn00500120_m1)。

組織内のシトクロム c オキシダーゼ (COX) 活性を測定するために、ビヒクル群、凍結融解群、または新鮮ミト群の偽手術ラットおよび CA 後 72 時間の生存ラットから脳と脾臓を採取しました。 組織ホモジネート中のCOX活性は、チトクロームCオキシダーゼキット(Abcam、ab239711)を製造業者の指示に従って使用して測定した。

CA後の急性期における脳灌流に対するMTxの影響を決定することを目的とした別の一連の実験では、CA後の最初の2時間、相対脳血流(rCBF)をモニタリングした。 脳のレーザースペックルイメージングは​​、前述のように [29]、メーカーの説明書 (RWD Life Science Co., Ltd.、広東省、中国) に従って全視野レーザー灌流イメージャー RFLS III システムを使用して実行されました。 正中線の頭皮切開を行って、画像化のために頭蓋骨を露出させた。 左皮質表面上の頭蓋骨を歯科用ドリルを使用して薄くし、硬膜が無傷であることを確認した。 イメージャは、薄くなった頭蓋骨の表面の真上に配置されました。 連続画像取得（時定数、1 秒、カメラ露出時間、5 ミリ秒、レーザー強度、100 mA、解像度、2048 × 2048）は、CA 前のベースラインから開始し、CA 後 2 時間まで継続しました。 血管は解剖学的特徴に従って認識され、その後、CA 前のベースラインで 3 つの関心領域 (ROI) が選択されました。 ROI には、左上大脳静脈上の領域と、上大脳静脈間の左皮質表面の 2 つの毛細血管領域が含まれていました。 灌流の信号強度は、レーザースペックルイメージングシステムソフトウェアを使用して各時点で計算され、ベースラインに対して正規化されました[29]。 3 つの ROI における rCBF 値の平均をグループ間で比較しました。

別の一連の実験では、共焦点顕微鏡を使用して重要臓器における標識ミトコンドリアの1時間後および24時間後の取り込みと持続性を確認するために、CAを受けたラットが使用されました。 新たに単離されたミトコンドリアは、単離直後に MitoTracker Deep Red で標識され、CA からの蘇生時にビヒクルまたは標識されたミトコンドリアが注入されました。 CA の 1 時間後または 24 時間後に動物を安楽死させ、脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓を採取し、4% パラホルムアルデヒド溶液で固定しました。 切片を 4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) (Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国) を含む封入剤で封入し、LSM 880 共焦点イメージング システム (Carl Zeiss Meditec AG、イエナ、ドイツ) を使用して観察しました。

データは平均±標準偏差を表します。 神経機能スコアは、クラスカル・ウォリス検定に続いてダンの多重比較検定を使用して比較されました。 連続データは、複数の実験グループ間の事後比較のためのシダック補正を伴う一元配置分散分析 (ANOVA) によって分析されました。 血行動態、体重変化、実験室データ、およびrCBFデータは、反復測定分析のための混合効果モデルを使用して検査され、その後、事後比較のためにシダック補正を備えたANOVAが続きました。 インビボ生存率研究では、効果の信頼性の高い測定を達成するために必要なサンプルサイズを計算するために検出力分析を実行しました。 CA後3日の平均生存率はビヒクルグループで40％、新たに単離したミトコンドリアグループで85％と予想されたため、各生存研究ではグループあたり11匹のラットが必要であると予想されました（α = 0.05、β = 0.2） [パワー = 80%]、両面)。 すべてのデータが含まれています (外れ値や動物は研究から除外されていません)。 Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定を使用した Kaplan-Meier 分析を使用して、グループ間の生存率を計算しました。 AP < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 すべての統計分析には、GraphPad Prism (v.9.2.0; GraphPad Software Inc.、ラ ホーヤ、カリフォルニア州、米国) を使用しました。

組織分離後、外因性ドナー ミトコンドリアを MitoTracker Deep Red で染色し、内因性ミトコンドリアが MitoTracker Green で染色されている神経細胞と共培養しました。 外因性脳ミトコンドリアは、24 時間の単純な共培養によって神経細胞に取り込まれました (図 1A)。 移入された外因性ミトコンドリア (赤) は、神経細胞からの内因性ミトコンドリア (緑) と共局在しており、融合した黄色の染色によって証明されるように、細胞内の外因性ミトコンドリアの移動を示しています。 さらに、外因性の筋肉由来のミトコンドリアの神経細胞への移行も観察されました（図 1B）。 これらの結果は、外因性の脳および筋肉由来のミトコンドリアが効率的に神経細胞に導入される可能性があることを示唆しています。

外因性の脳および筋肉由来のミトコンドリアの神経細胞培養物への移入。 MitoTracker Deep Red で染色し、脳細胞と共培養した外因性ミトコンドリアの代表的な画像。その内因性ミトコンドリアは MitoTracker Green で染色されました。 外因性ミトコンドリア (赤色) は、ドナー ラットの脳 A または胸筋 B から抽出されました。 スケールバーは20μmを示します

我々の最も重要な発見は、ポストCAラットに新たに単離したミトコンドリアを注入して治療した場合、2つの対照条件と比較して神経学的に無傷な生存率が劇的に増加したことである。 11 匹の動物からなる 3 つのグループは、それぞれ以下から構成されます：（1）ネガティブ コントロールとしての単純なビヒクル処理（0.49% BSA を含む呼吸緩衝液）、（2）凍結融解した非機能性ミトコンドリアの追加のネガティブ コントロール、および（3）私たちのMTx介入グループには、新たに単離されたドナーミトコンドリアが投与されました。 図 2A は、凍結解凍したミトコンドリアと比較して、新たに単離したミトコンドリアが機能していることを示しています。 予想通り、新たに単離したミトコンドリアの ATP 含有量は、凍結解凍したミトコンドリアよりも約 4 倍高かった。 フローサイトメトリー分析により、ΔψM が凍結解凍 mito グループと比較して新鮮 mito グループで著しく高いことが確認されました (65.60 ± 18.50、19.06 ± 6.28、P = 0.047)。 CCCPは、凍結解凍ミトグループのΔψMを変化させませんでした（図2B）。 これらの観察は、新たに単離されたミトコンドリアが凍結融解ミトコンドリアよりも著しく高いΔψMを有し、凍結融解プロセスが膜電位を破壊するのに十分であり得ることを示唆している。

新たに単離されたミトコンドリアは、凍結解凍されたミトコンドリアよりも機能的です。 A ビヒクル、凍結融解ミトコンドリア、およびミトコンドリア単離直後の新鮮ミトコンドリア中のミトコンドリア ATP 含有量。 事後比較のためのシダック補正を伴う一元配置分散分析 (ANOVA) が使用されました。 グループあたり n = 3 ～ 4。 B JC-1で染色した単離ミトコンドリアのミトコンドリア膜電位のフローサイトメトリー分析により、J凝集体の割合が凍結解凍mitoグループよりも新鮮mitoグループの方が著しく高いことが確認されました。 シアン化カルボニル 3-クロロフェニルヒドラゾン (CCCP) は、凍結-解凍-mito グループの ΔψM を変化させませんでした。 事後比較のためのシダック補正を伴う一元配置分散分析が使用されました。 グループあたり n = 4

CAのin vivoラットモデルでは、ビヒクル群、凍結融解群、および新鮮なミト群の間で、ベースライン特性および周術期の血行力学的パラメータに差は観察されなかった(表1)。 ビヒクル群および凍結融解ミト群の両方における７２時間生存率は５４．５％であった（両群のラット１１匹中６匹）。 対照的に、新鮮なミトコンドリアの静脈内注射を受けた動物は、90.9％の72時間生存率の大幅な改善を示しました（11匹中10匹のラット; P = 0.048対ビヒクル; P = 0.038対凍結解凍ミト）（図3A） 。 さらに、生存を条件として、CA 後 72 時間の時点で、NFS はビヒクルグループよりもフレッシュミトグループの方が有意に高かった（P = 0.047）（図 3B）。 また、蘇生後 72 時間の生存ラットの体重維持の尺度も評価しました。 CA 後 72 時間の時点で、新鮮な mito グループの体重は、凍結解凍された mito グループの体重よりも有意に高かった (図 3C)。

新たに単離されたミトコンドリアを使用したミトコンドリア移植は、心停止と蘇生後の 72 時間の神経機能と生存率を改善します。 A 心停止 (CA) と蘇生後の最初の 72 時間の生存率。 グループあたり n = 11。 *P = 0.048 対ビヒクル群; #P = 0.038 対 凍結解凍水戸グループ。 Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定を使用した Kaplan-Meier 分析が使用されました。 B ビヒクル、凍結融解ミトコンドリア、または新たに単離したミトコンドリア グループにおける生存動物における CA 後 72 時間の神経機能スコア (NFS)。 スコア 0 は脳死またはラットの死を示します。 死んだ動物は分析から除外された。 クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの多重比較検定が使用されました。 C ビヒクル、凍結融解ミトコンドリア、または新鮮ミトコンドリアで処理された CA 後の動物の体重の毎日の変化。 反復測定分析には混合効果モデルを使用し、その後、事後比較のためにシダック補正を使用した一元配置分散分析を使用しました。 *P = 0.044 対車両グループ。 データは平均値 ± 標準偏差を表します

図 4A は、ビヒクル群および凍結解凍群で観察されたより高い乳酸値レベルと比較して、フレッシュミト群で蘇生後 15 分以内に CA 後ラットで観察された動脈乳酸値の有意な低下を示しています。 また、蘇生後 72 時間の肺水分量を測定することで肺水腫を評価しましたが、フレッシュミト群ではビヒクル群 (5.70 ± 0.75、P) と比較して、フレッシュミト群 (W/D、4.23 ± 0.85) で著しく低かったです。 = 0.027) および凍結融解グループ (6.21 ± 1.40、P = 0.003) (図 4B)。 心エコー検査により、初期の血行動態パラメータに有意差がないことが確認されました。 予想通り、CA はすべてのグループで蘇生後 2 時間で LVEF の低下をもたらしました (図 4C)。 ただし、蘇生後の最初の 2 時間のモニタリングでは、動脈圧、心拍数、左心室駆出率の血行力学的パラメーターについて、MTx グループとコントロール グループの間の有意差を特定できませんでした (図 4C、D)。 この時点以降、モニタリングは中止されました。 したがって、この時点を超える可能性のある変化は観察できませんでした。 さらに、我々は、ビヒクル群および凍結融解群と比較して、新鮮なミト群において１５分でのより高い動脈ｐＨおよびより低い動脈二酸化炭素分圧を観察した。 CA直後の動物では典型的にはかなり上昇しているグルコースレベルが、他のグループと比較してMTxを受けた動物では15分後には低下した。 注目すべきことに、これらのレベルはすべて 120 分でベースラインに戻りました (図 5)。 各グループは、酸素分圧、酸素飽和度、塩基過剰、ヘマトクリット、血中電解質レベルに関して差異はありませんでした（追加ファイル 1：図 S1）。

ミトコンドリア移植は、早期の乳酸正常化を促進し、心停止および蘇生後の肺損傷を軽減します。 A 安静前のベースラインおよび蘇生後 15 分および 120 分の時点での動脈乳酸値。 グループあたり n = 11。 反復測定分析の混合効果モデルと、事後比較のためのシダック補正を伴う一元配置分散分析 (ANOVA) が使用されました。 B 蘇生後 72 時間の心停止誘発性肺水腫は、新たに単離されたミトコンドリアを送達することによって軽減されました。 C ビヒクル、凍結融解ミトコンドリア (frozen-thawed-mito)、または新たに単離したミトコンドリア (fresh-mito) で処理した逮捕後ラットにおける、逮捕前ベースラインおよび蘇生後 2 時間の左心室駆出率。 反復測定分析には混合効果モデルを使用し、その後、事後比較のためにシダック補正を使用した ANOVA を使用しました。 D 平均動脈圧 (MAP) の変化。 反復測定分析には混合効果モデルを使用し、その後、事後比較のためにシダック補正を使用した ANOVA を使用しました。 データは平均値 ± 標準偏差を表します

ミトコンドリア移植は、心停止および蘇生後の早期に代謝パラメータを正常化します。 動脈 A pH、B 二酸化炭素分圧 (PaCO2)、C グループ間の CA 前ベースラインおよび蘇生後 15 分および 2 時間のグルコース レベル。 *P < 0.05; フレッシュミト対ビヒクル群、#P < 0.05; 生水戸派 vs 冷凍解凍水戸派。 グループあたり n = 11。 反復測定分析には混合効果モデルを使用し、その後、事後比較のためにシダック補正を使用した ANOVA を使用しました。 データは平均値 ± 標準偏差を表します

新鮮なミトコンドリア注射の有益な効果のメカニズムをさらに特徴付けるために、我々は、ミトコンドリア分裂のマーカー（Drp1、Fis1）およびミトコンドリア融合（Opa1、Mfn1、Mfn2）の遺伝子発現の変化を、脳および脾臓からの組織ホモジェネートにおいて測定した。ビヒクル群、凍結融解群、または新鮮ミト群における偽手術ラットまたはCA後72時間の生存ラット。 結果を図６に示す。脳内では、新鮮なミトコンドリアは、凍結融解したミトコンドリアと比較して、すべての融合タンパク質の遺伝子発現を顕著に減弱させた。 新鮮なミトコンドリアを含むMTxは、溶媒グループと比較してMfn1およびMfn2の遺伝子発現を著しく減少させましたが、凍結融解ミトコンドリアは分裂タンパク質または融合タンパク質のいずれの遺伝子発現にも影響を与えませんでした。 ミトコンドリア分裂遺伝子に関しては、両グループに違いはありませんでした。 脾臓では、新鮮なミトコンドリアは、凍結解凍したミトコンドリアと比較して、Opa1 の遺伝子発現を著しく減少させました。 さらに、脾臓における Drp1 遺伝子発現は、溶媒グループよりも新鮮なミトグループで顕著に高かった。

ミトコンドリア移植の有無にかかわらず、心停止および蘇生後 72 時間後の生存ラットの脳および脾臓における遺伝子発現の変化。 A脳およびB脾臓におけるミトコンドリア分裂タンパク質（ダイナミン関連タンパク質1［Drp1］、ミトコンドリア分裂1タンパク質［Fis1］）およびミトコンドリア融合タンパク質（視神経萎縮-1［Opa1］、ミトフシン-1）に関連する分子の遺伝子発現[Mfn-1]、ミトフシン-2 [Mfn-2]）は C 脳および D 脾臓に存在します。 事後比較のための Sidak の補正を伴う ANOVA を使用しました。 ビヒクル、凍結解凍ミト、新鮮ミトのグループでは、それぞれ n = 6、6、および 10。 データは平均値 ± 標準偏差を表します

また、ビヒクル群、凍結融解群、または新鮮ミト群における、偽手術ラットまたはCA72時間後の生存ラットの脳および脾臓からの組織ホモジネート中のCOX活性を測定した。 結果は追加ファイル 1: 図 S2 に示されています。 比色酵素アッセイでは、脳と脾臓の両方で COX 活性に関して両グループに違いがないことが示されました。 ビヒクル群の COX 活性は偽手術群と比較して変化がなく、生存動物の CA 蘇生後 72 時間で組織ホモジネートの COX 活性が回復したことを示唆しています。

神経機能に対するMTxの影響をさらに特定するために、CA後の2時間の脳血流に対するMTxの影響を測定する別の一連の動物研究を実施しました。 脳の皮質表面上の 3 つの ROI で rCBF (相対値はベースラインを指します) を測定しました。 レーザースペックルイメージングシステムを使用し、CA中からCA後2時間まで分ごとに測定されたrCBFを比較しました。 図 7A は、ベースラインおよび CA 2 時間後の 3 つのグループのそれぞれの動物からの 3 つの ROI の代表的な画像を示しています。 図 7B は、3 つのグループにおける脳灌流の回復を比較しています (各グループの n = 6)。 MTxを受けたCA後のラットは、どちらの対照群と比較しても2時間の時点でrCBFが改善しました:フレッシュミト群では107.7%±5.6%、ビヒクル群では77.5%±4.5%(P<0.0001)、81.3%±凍結解凍ミト群では15.9％（P＝0.024）。

ミトコンドリア移植は、心停止および蘇生後の早期に脳灌流を強化します。 3 つのグループにおける CA 前のベースラインと CA の 2 時間後におけるレーザー スペックル コントラスト イメージングの代表的な写真。 B ビヒクル、凍結解凍ミトコンドリア (frozen-thawed-mito)、または新たに単離したミトコンドリア (fresh-mito) で処理した CA 後ラットにおける ROI の平均相対脳血流 (rCBF) の変化。 反復測定分析には混合効果モデルを使用し、その後、事後比較のためにシダック補正を使用した ANOVA を使用しました。 グループあたり n = 6。 データは平均値 ± 標準偏差を表します

追加の一連の動物研究では、レシピエント CA 動物の重要な器官および組織内の標識された新たに単離されたドナー ミトコンドリアの視覚的残存性を顕微鏡検査によって測定しました。 MitoTracker Deep Red で標識したミトコンドリアの共焦点蛍光イメージングにより、CA 投与後 1 時間および 24 時間後に、移植されたミトコンドリアが脳、腎臓、脾臓で観察されることが確認されました (図 8)。 心臓、肝臓、または肺内では、24時間後に標識されたミトコンドリアの同様の持続性は観察されませんでした（追加ファイル1：図S3）。

共焦点蛍光イメージングにより、心停止および蘇生後 1 時間および 24 時間での臓器内のドナー ミトコンドリアの残存が明らかになります。 移植されたミトコンドリア (赤色) は、心停止から 1 時間後と 24 時間後に脳、腎臓、脾臓で観察されました。 矢印は、注入前に MitoTracker Deep Red 色素を使用して標識された提供されたミトコンドリア粒子を示します。 細胞核を DAPI (青色) で対比染色しました。 スケールバーは20μmを示します

この論文では、CA で見られる重度の虚血性損傷によって引き起こされる損傷を MTx が軽減する可能性について報告します。 我々は、ラットを10分間の仮死CAから蘇生させたラットモデルにおいて、MTxが神経学的に無傷な生存率を劇的に増加させることを発見した。 この生存期間の改善は、代謝、脳血流、肺水腫の改善と関連していました。 私たちの in vitro 研究では、神経細胞培養物が外因性の新たに単離されたドナー ミトコンドリアを容易に取り込み、ドナー ミトコンドリアが呼吸して ATP を産生できることが確認されています。 追跡調査の in vivo 研究では、静脈内注入された移植ドナー ミトコンドリアが CA の 24 時間後に組織内で見つかる可能性があることが判明しました。

私たちの主な発見は、MTx が CA 後の生存率を 55% から 91% に改善したということでした。 CA の設定における MTx の先行研究を見つけることができませんでした。 ただし、MTx は、心臓 I/R [10、11、12、13、14、15、16、17]、脳卒中 [6、18]、肝臓 I/R などの他の動物疾患モデルにおいて保護効果があることが報告されています。 [30、31]、腎臓 I/R [32、33]、肺 I/R [25]、脊髄損傷 [34]、パーキンソン病 [35、36]、統合失調症 [37]。 たとえば、マウス脳卒中モデルでは、胎盤組織由来のミトコンドリアが局所頸動脈閉塞後の動物に静脈内注入され、これにより 72 時間で梗塞サイズが大幅に減少しました [18]。 虚血脳では、アストロサイトが健康なミトコンドリアを損傷したニューロンに移入する可能性があります[6]。 別の研究では、ラットの筋肉由来ミトコンドリアの移植により、細胞の酸化ストレスとアポトーシスが減少し、脳梗塞体積が減少し、虚血性脳卒中後の神経障害が回復することが判明した[38]。

また、凍結融解プロセスにより、単離されたミトコンドリア粒子のATP含有量とΔψMが著しく減少することも検証しました。 この発見は 2 つの理由から重要です: (1) McCully らによって報告された迅速な単離手順を使用した結果、機能的な ATP 生成ドナー ミトコンドリアが抽出されたこと、および (2) ミトコンドリアの凍結および解凍は、重要な追加のネガティブ コントロール グループとして後続のシリーズに使用される、比較的機能しないミトコンドリアを生成しました。 注目すべきことに、MTxに関するこれまでの研究のほとんどは、単一のネガティブコントロールグループとして単純なビヒクル溶液のみを使用していました[10、11、12、13、14、16、18、25、33、35、36、37、39]。 私たちのMTx調査では、結果の変化に必要なのは注入されたミトコンドリアの機能的能力であり、機能していないミトコンドリア粒子に存在する別の成分の注入によるものではないことを確認したかったのです。 機能しない凍結融解したミトコンドリア粒子には、同様の量のミトコンドリア膜、タンパク質、およびその他の高分子が含まれており、これらの成分の一部は生物学的活性を有し、おそらく損傷に関連する分子パターンまたはシグナル伝達分子として機能する可能性があると考えるのが合理的です。 凍結融解したミトコンドリアを追加のネガティブコントロールとして使用すると、重要な可能性のある交絡因子を排除できます。

特に MTx を使用した人体試験のいくつかはすでに実施されており、他の試験は進行中であり、さらに多くの試験が予想されているため、私たちの発見は急速に人間に応用される可能性があります。 MTxはすでに、心臓手術後の心筋虚血を患う小児患者に使用されている[39、40]。 グアリエントら。 は、重度の先天性心疾患を患い、人工心肺装置で自分自身のミトコンドリアを注射された小児患者について報告しました。 彼らの研究では、離乳プロセスをスピードアップするためにMTxが実行され、ある程度の成功が報告されました[39、40]。 さらに、脳虚血中に脳に送達される自己MTxの安全性を調査するための人体研究が進行中です。 ウォーカーら。 彼らは、患者の筋肉組織を生検してベッドサイドでミトコンドリアを単離し、新たに単離したミトコンドリアを患者の脳に直接注入した(NCT04998357)。 ここで紹介した一連の研究がこの分野の研究をさらに刺激することを願っています。

私たちの研究では、24時間の単純な共培養を通じて、外因性ミトコンドリアが培地中を移動し、神経細胞培養において内因性ミトコンドリアと共局在することを実証しました。 ミトコンドリアがある細胞から別の細胞に移動する能力は最近発見されたものですが、現時点ではほとんど理解されていない現象です。 私たちの結果は、ミトコンドリアが細胞膜を越えて容易に移動することを裏付けています。 これは、これまで認識されていたよりも頻繁に起こる自然発生的な出来事である可能性があります。 さまざまな研究が私たちの in vitro での発見を裏付けています。 アンドラビら。 は、アストロサイトおよびミクログリアから損傷したニューロンへのミトコンドリアの移動を実証した[41]。 早川ら。 細胞外空間に放出されたミトコンドリアが、脳卒中後に脳内で細胞から細胞へ移動できることを発見しました。 これらの発見は、脳 I/R 損傷後の内因性神経保護に寄与する可能性がある神経膠細胞クロストークの新しいミトコンドリア機構を示唆しています [6、18]。 スピースら。 は、間葉系幹細胞から機能不全のミトコンドリアを有する哺乳動物細胞への正常なミトコンドリアの細胞間移動を実証した[42]。 したがって、ミトコンドリアは細胞間のコミュニケーションと機能において重要な役割を果たしているとますます考えられており[41、42、43、44]、健康な細胞から損傷を受けた細胞へのミトコンドリアの移動は有望な治療法であると思われる[6]。 、8、9]。 I/R中に外因性ミトコンドリアが細胞に取り込まれる正確なメカニズムを決定し、細胞外ミトコンドリアがどのように生存能力を維持し、組織に移動し、移植プロセス中に組織を保護するように機能するかを解明するには、さらなる研究が必要です。

遺伝子発現測定の我々の結果は、CAから蘇生した生存動物の回復期中に、新鮮ミトグループのミトコンドリア動態が分裂方向にシフトしていることを示唆しており、これは新鮮ミトコンドリア補給の有益な効果と関連している可能性がある。 Drp1 阻害剤によるミトコンドリア分裂の阻害は、全虚血および再灌流後の脳損傷に対して有益な効果をもたらすことが示されています [45]。 対照的に、以前の研究では、Drp1 または siRNA の阻害による核分裂の抑制が、虚血性低酸素損傷後の ROS 生成、シトクロム c 放出、カスパーゼ 3 の活性化などの損傷したミトコンドリア媒介損傷の増加に寄与し、虚血性脳損傷を悪化させることが実証されました。 [46]。 ミトコンドリアの分裂により、損傷したタンパク質、変異した DNA、または不安定な膜を含む機能不全のミトコンドリアをミトコンドリアが分離できることが実証されています [47]。 これらの矛盾した結果は、分裂と融合のバランスと脳の回復におけるその役割がまだ解明されていないことを示唆しています。 さらに、ミトコンドリア動態の役割は、急性期だけでなく、虚血再灌流傷害からの回復後期についてもまだ不完全に研究されています。 CA蘇生後のミトコンドリア動態および脳損傷に対するMTxの役割を解明するには、さらなる研究が必要である。

我々の研究における重要な発見は、CAの24時間後の動物の重要な組織における蛍光標識されたミトコンドリアの持続である。 現在までのところ、静脈内注入後に循環ドナーミトコンドリアが取り込まれる解剖学的位置に関する文献は限られています。 多くの先行研究では、心筋へのミトコンドリアの直接注入および冠動脈内注入が研究されている。 これらの研究では、ドナーのミトコンドリアが心臓の虚血領域内に保持されるが、他の臓器には保持されないことが実証されました[10、11、16]。 対照的に、私たちが実施したのと同じ静脈内注入を使用した中村らの研究では、脳卒中後の虚血脳領域でミトコンドリアが見つかることに加えて、注入されたミトコンドリアが肺、肝臓、心臓などのさまざまな末梢臓器でも確認されることが実証されました。腎臓、心臓[18]。 Shiらによる最近の研究。 は、MTxの結果としてパーキンソン病の機能的改善を実証しました。 彼らの研究は、脳、肝臓、腎臓、筋肉、心臓を含む多くの異なる組織における静脈内注入された外因性ミトコンドリアの広範な分布を明らかにし、パーキンソン病の一部はミトコンドリア病の多臓器後遺症によって引き起こされる可能性があると推測した[36]。 CAの24時間後に複数の臓器における外因性ドナーミトコンドリアの取り込みが確認されましたが、注入されたミトコンドリアの細胞取り込みのメカニズムは不明のままです。 外因性ミトコンドリアが細胞エンドサイトーシス経路を介して侵入する可能性があることが示唆されている[48、49、50]。 膜貫通取り込み機構を解明し、どの組織や細胞が最も多く注入されたミトコンドリアを取り込むかを定義し、標的組織内で移植されたミトコンドリアが持続するタイムラインをさらに明らかにするには、さらなる研究が必要である。

私たちの研究に特有なのは、追加のネガティブコントロールとして非機能的な凍結融解ミトコンドリアを使用することです。 これらの凍結解凍されたミトコンドリアには、新たに単離されたミトコンドリアに見られる保護効果はまったくありませんでした。 これは、移植を成功させるには、比較的健康な呼吸と ATP 産生ミトコンドリアの要件を示唆しています。 他の研究では、MTx が ATP レベルを改善し [51]、ミトコンドリアペプチドを保護し、過剰な炎症誘発性反応を防止し [52]、細胞死経路の活性化を低減できることが実証されています [53]。 それにもかかわらず、多くの重要な疑問が残っています。

ここで紹介する予備研究には多くの制限があります。 MTx が生存転帰を改善する正確なメカニズムはまだ不明です。 レシピエント組織のATPレベルがMTxによって変化するかどうかはまだ確認されていません。 我々は取り込まれたミトコンドリアの数を定量化しなかったし、ミトコンドリアを取り込んだ組織が転帰の改善に最も関与する組織であるかどうかも判断しなかった。 さらに、MTx の投与量とタイミングが最適ではない可能性があります。 私たちの動物 CA モデルは比較的短期間の 72 時間モデルです。 したがって、長期的な利益（または悪影響）は不明のままです。 測定値の多くは特定の時点で取得されました。 したがって、他の時点で発生した重大な変化を検出できなかった可能性があります。 ヒトの治療法に応用するには、ドナーミトコンドリアの最適用量、最適な単離方法、I/R損傷を治療するためのMTxの理想的なタイミングを解明するために追加の研究が必要です。 さらに、我々はこれらの研究を同種異系MTxに焦点を当てました。 ただし、これは急性期の臨床現場では実現できない可能性があります。 実用的なヒト治療法の開発では、同種移植や自家移植ではなく、異種移植の可能性が将来の実現可能な方向性として示唆されている[11、54、55]。

CAからの蘇生直後にMTxを実行すると、ラットの生存率と神経学的回復が改善されることがわかりました。 MTx は、乳酸、pH、およびグルコースレベルの急速な回復と関連していました。 微小循環と脳灌流の改善。 そして肺損傷の減少。 これらの結果は、ミトコンドリア生物学の基本的な理解を強化し、CA後に現在失われている命を救うための新しい治療戦略としてMTxの開発を促進するための将来の研究の基盤を提供します。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

ミトコンドリア移植

心停止

アデノシン三リン酸

虚血と再灌流

リン酸緩衝生理食塩水

ウシ血清アルブミン

ミトコンドリア膜電位

シアン化カルボニル 3-クロロフェニルヒドラゾン

呼吸数

一回換気量

神経機能スコア

左心室駆出率

湿潤重量と乾燥重量の比

ダイナミン関連タンパク質 1

ミトコンドリア分裂 1 タンパク質

視神経萎縮-1

ミトフシン-1

ミトフシン-2

シトクロムCオキシダーゼ

相対的な脳血流量

関心のある領域

4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール

分散分析

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なし。

この研究は、ノースウェルヘルスのファインスタイン医学研究研究所の救命救急生理学研究所の基金によって支援されました。

ファインスタイン医学研究所、ノースウェルヘルス、マンハセット、ニューヨーク州、救命医療生理学研究所

Kei Hayashida, Ryosuke Takegawa, Yusuke Endo, Tai Yin, Rishabh C. Choudhary, Tomoaki Aoki, Mitsuaki Nishikimi, Eriko Nakamura, Muhammad Shoaib, Cyrus Kuschner, Santiago J. Miyara, Junhwan Kim, Koichiro Shinozaki & Lance B. Becker

免疫学および炎症センター、ファインスタイン医学研究研究所、ノースウェル・ヘルス、マンハセット、ニューヨーク州、米国

村尾淳 & 王萍

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概念化：KHとLBB。 方法論: KH、RT、YE、TY、RCC、TA、MN、AM、EN、MS、CK、SJM、JK、KS、PW、および LBB。 調査: KH、RT、YE、TY、RCC、MN、AM、EN。 ビジュアライゼーション：KH. 資金調達：KHとLBB。 プロジェクト管理: LBB。 執筆―原案：KH. レビューと編集：KHとLBB。 著者は最終原稿を読んで承認しました。

Kei Hayashida または Lance B. Becker への通信。

適用できない。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

動脈血および代謝測定値は、逮捕前のベースラインと蘇生後 15 分および 120 分にサンプリングされました。 図S2。 ビヒクル群、凍結融解群、または新鮮ミト群における CA 後 72 時間の生存動物の脳および脾臓からの組織ホモジネートにおけるチトクロム c オキシダーゼ (COX) 活性。 図S3。 ビヒクルまたは新鮮なミトコンドリア移植で治療したラットのCA蘇生後24時間の心臓、肝臓、肺の共焦点蛍光イメージング。

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転載と許可

林田和也、武川龍也、遠藤裕也 他外因性ミトコンドリア移植は、心停止からの蘇生後の生存率と神経学的転帰を改善します。 BMC Med 21、56 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s12916-023-02759-0

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受信日: 2022 年 10 月 4 日

受理日: 2023 年 1 月 30 日

公開日: 2023 年 3 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02759-0

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