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Mar 16, 2023

がん細胞株および循環腫瘍細胞の抗原発現の測定

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 6051 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

循環腫瘍細胞 (CTC) の EpCAM ベースの濃縮技術を評価する場合、使用する細胞株は実際の CTC によく似ている必要があります。これは、CTC の EpCAM 発現を知る必要があることを意味しますが、異なる施設や時点での細胞株の EpCAM 発現も知る必要があります。重要。 血液中のCTCの数は少ないため、13人の前立腺がん患者の診断用白血球除去製品から白血球を除去してCTCを濃縮し、定量的フローサイトメトリーを使用してEpCAM発現を測定しました。 各施設の培養物を測定することにより、複数の施設間で抗原発現を比較しました。 使用した細胞株の 1 つについても捕捉効率を測定しました。 結果は、去勢感受性前立腺がん患者由来のCTCは、EpCAM発現はさまざまだが比較的低く、患者あたりの発現中央値は細胞あたり35～89,534（平均24,993）分子の範囲であることを示した。 異なる施設で培養された同一の細胞株の抗原発現には大きなばらつきがあり、CellSearch システムを使用した場合、同じ細胞株に対して 12 ～ 83% の範囲の回収率が得られました。 私たちは、同じ細胞株を使用しても捕捉効率に大きな違いが生じる可能性があると結論付けています。 去勢感受性前立腺がん患者由来の本物の CTC によく似ているためには、EpCAM 発現が比較的低い細胞株を使用し、その発現を頻繁にモニタリングする必要があります。

細胞株は、さまざまな方法を比較したり、循環腫瘍細胞 (CTC) の濃縮および単離のためのプロトコルを最適化するためによく使用されます。 使用した細胞株は、いくつかの濃縮技術を比較する記事やレビューに記載されています 1、2、3、4。 サイズ、変形性、抗原発現などの特性は異なる細胞株間で大きく異なる可能性があるため、これにより一見より公平な比較が可能になります。 特に後者の特性は、抗原ベースの濃縮技術を評価する場合に非常に重要です。

選択的な稀少細胞捕捉に表面抗原を使用する場合、捕捉された細胞の保持を考慮しながら、コーティングされた表面と細胞の間に多数の相互作用を生成する必要があります。 このために最も使用される方法は、（超常）磁性ビーズが抗体でコーティングされる免疫磁気捕捉です5。 CTC 捕捉の場合、ほとんどの場合、関連する抗原は上皮細胞接着分子 (EpCAM) です。この抗原は、腫瘍組織と CTC の両方における上皮由来のほとんどのがんで過剰発現されます 6。 免疫磁気濃縮の例としては CellSearch システムがあり、これは CTC 濃縮に最もよく使用される方法です 7。

このような濃縮の効率は、細胞表面に存在する抗原の数に大きく依存します。 したがって、これらの技術を評価する場合は、同等の発現特性を持つ細胞株を使用する必要があり、それによって実際の CTC をより厳密に模倣することができます。 ここでは、捕獲に使用される特性だけでなく、CTC の識別に使用される特性も考慮する必要があります。 たとえば、よく使用される LNCaP 細胞株のサイトケラチン (CK) 発現レベルは、患者 CTC の発現レベルよりもはるかに高いことが示されており、その同定は非現実的に簡単になっています。

EpCAM が低い、または EpCAM 陰性の CTC の亜集団の存在に関する最近の洞察を考慮すると、現実的な EpCAM 発現を持つ細胞株を使用することはさらに関連性が高くなります 9、10、11、12、13。 すでにいくつかの研究では、追加の抗原の使用 14,15 または生成される磁力の増加 16,17,18 のいずれかによって、抗原ベースの捕捉法の感度を高めることが試みられていますが、その多くは完全に EpCAM に依存しない捕捉法にも焦点を当てています 19。 これらの方法はすべて、低 EpCAM 発現細胞も捕捉するように設計されています。 CellSearch システムでも、特許取得済みの特殊なアプローチを使用して、EpCAM 発現が低い CTC に十分な磁性粒子を結合します20。

一般に感度の向上は特異性を犠牲にして行われるため、そのようなシステムに必要な感度を知ることは有益です。 このためには、患者サンプル中の CTC の抗原発現レベルを知る必要があります。 CTC 上の EpCAM の発現を評価した研究はいくつかありますが 21、22、23、我々の知る限りでは Rao et al. のみです。 らは、CTC の EpCAM 発現を定量的に測定することを試み24、測定された EpCAM 発現といくつかの一般的に使用される細胞株との間に大きな違いがあることを示しました。 ただし、この研究では、CTC を同定するための最小限の EpCAM 発現閾値を設定し、それによって EpCAM の低い CTC または陰性 CTC を除外しました。 これは、最も代表的な細胞株を効果的に選択できるようにするためには、全 CTC 集団における EpCAM 発現の定量化が必要であり、EpCAM ベースの捕捉アッセイの感度を現実的に決定できることを意味します。

この目的のためには、CTC における EpCAM 発現だけでなく、いくつかの細胞株の EpCAM 発現も知る必要があります。 in vitro での細胞特性は時間の経過とともに変化することが知られているため 25、現在の抗原発現レベルだけでなく、その変動も重要です。 この変動は、ATCC が推奨する培養条件を幅広く遵守することで最小限に抑えることができると考えられます。 しかし実際には、施設に依存した文化条件が適用されることが多く、施設間で大きな差異が生じる可能性があります。 これをテストするために、当社独自の標準培養条件を使用して培養した場合のさまざまな細胞株、および標準培養条件を使用してさまざまな施設で培養された細胞について、いくつかのがん関連抗原の発現を測定しました。

特に非転移性癌だけでなく、早期転移性癌における CTC は非常にまれであるため 26、その特性の測定は困難です。 より多くの CTC を取得する方法は、より大量の血液の検査を可能にする白血球除去療法 27 を使用することです。 したがって、EpCAM 発現レベルを定量的に測定することを目的として、非 EpCAM マーカーを使用して、白血球除去由来の患者サンプル中の前立腺がん CTC を同定しました。 さらに、我々はそれらの EpCAM 発現を、よく使用されるいくつかの癌細胞株の EpCAM 発現と比較しました。

さまざまな抗原の発現を定量化するために、フィコエリトリン (PE) に結合したモノクローナル抗体を使用して細胞を染色し、その後定量的フローサイトメトリーを使用して細胞あたりの PE 分子の数を決定しました。 PE 分子の数は抗原の数と正確に同じではありませんが、この研究では、細胞あたりの PE 分子の数を、発現された抗原の数を表すものとして扱います。

抗原発現は、結合蛍光団を有する抗体を使用して直接測定することも、蛍光団に結合した二次抗体を使用してタグ付けされた非結合抗体を介して測定することもできます。 図 1A は、使用した 5 つの細胞株すべてで測定された発現が、直接結合抗体を使用して EpCAM 抗原を標識した場合、二次抗体染色を使用した場合と比較して低いことを示しています (Wilcoxon Signed Ranks Test、p < 0.0001)。 ポリクローナル二次抗体 (抗マウス PE など) を使用する場合、複数の抗体が一次抗体に結合して、より高い PE シグナルが得られるため、これは予想されます。 この現象は定量化された発現の違いと一致しており、最大 3 倍（平均 2.1、範囲 0.7 ～ 3.6）異なります。 この変動はすべての細胞株で見られるため、細胞株間の相対的な発現の差は同様のままです。

(A) 直接結合抗体を使用して、または二次抗体染色によって測定された、未固定の PC3 (N = 11)、MCF7 (N = 4)、SKBR3 (N = 4)、および LNCaP (N = 11) の EpCAM 発現。 (B) 未固定細胞または 1% ホルムアルデヒド固定細胞を使用して測定された LNCaP 細胞の EpCAM および Her2 発現 (N = 3)。 (C) 未固定、CellSave 固定、および 1% ホルムアルデヒド固定 LNCaP および PC3 細胞の 24 時間後に測定した CK、Her2、および EpCAM 発現 (N = 1)。

私たちの場合、サンプル収集と患者サンプルの抗原定量の間の時間は約 24 時間であり、抗原発現はこの期間にわたって保存される必要があることを意味します。 多くの場合、これは固定によって達成されます28。CellSave (Menarini-Silicon Biosystems) や Cytochex (Streck) などの穏やかな固定剤、または Transfix (Caltag Medsystems) や 1 ～ 4% ホルムアルデヒド (Merck) などのより強力な固定剤を使用します。 。 過酷な固定が EpCAM およびヒト上皮成長因子受容体 2 (Her2) の発現測定に与える影響は、4 つの独立した実験で測定されました。 図 1B では、測定された抗原発現の有意な減少 (Wilcoxon Signed Ranks Test、p = 0.002) が細胞固定時に見られ、平均 72% (範囲 52 ～ 93%) の減少であることがわかります。 また、4 °C で保存した未固定細胞、CellSave 固定細胞、および 1% ホルムアルデヒド固定細胞を使用して、24 時間後の CK、Her2、および EpCAM の発現をテストしました。 図 1C の結果は、CellSave を使用した場合、未固定細胞と比較して EpCAM および Her2 の発現がより高く保存されていることを示していますが、ホルムアルデヒド固定により細胞内サイトケラチンが大幅に減少しました。これはおそらく、透過化剤が細胞を十分に透過化できないことが原因であると考えられます。架橋膜により、比較的大きな PE 蛍光体の通過が可能になります。

PC3、PC3-9、および LNCaP 細胞株の細胞では 20 か月の期間にわたって EpCAM および Her2 の発現を 2 か月ごとに測定し (11 回の測定)、MCF7 および SKBR3 細胞株の細胞では 6 か月の期間にわたって EpCAM および Her2 の発現を測定しました。 (4 回の測定)、図 2。 ここで、PC3 と LNCaP (p = 0.17)、PC3 と PC3-9 を比較した場合を除き、Her2 の発現における統計的に有意な差 (p < 0.02) が細胞株のすべての組み合わせで見つかりました。 (p = 1) または MCF7 を使用した LNCaP (p = 1)。 EpCAM 発現は、他のすべての細胞株と比較して、PC3 と PC3-9 の両方の間で有意な差を示しました (p < 0.01)。 PC3 と PC3-9 (p = 0.07)、LNCaP と SKBR3 (p = 0.20)、MCF7 と LNCaP (p = 1)、または MCF7 と SKBR3 (p = 0.14) の EpCAM 発現間に有意差は見つかりませんでした。これらの細胞株では、同じ細胞株内で測定された発現の変動がこのデータセット内で非常に大きく、これらの細胞株間の発現の差を顕著に区別できます。

6 か月または 20 か月の期間にわたって測定された、未固定 PC3、PC3-9、MCF7、SKBR3、LNCaP、およびホルムアルデヒド固定 LNCaP における (A) Her2 および (B) EpCAM の発現。 ボックスは中央値を水平線として 25 ～ 75 パーセンタイルを示し、ひげは 10 ～ 90 パーセンタイルを示します。

各細胞株内で見られる変動が抗原発現の変化によって引き起こされたのか、それとも実験的変動によって引き起こされたのかを評価するために、同じ6か月間、LNCaP細胞の固定サンプルでHer2およびEpCAMの発現も測定しました（図2を参照）。未固定 LNCaP 細胞の Her2 発現の中央値は細胞あたり 46,523 分子でしたが、固定サンプルでは 80% 減少して 9,133 抗原となりました (p < 0.01)。これは、図 1B に見られるように固定の効果に起因すると考えられます。 しかし、固定サンプルの Her2 発現の変動係数 (CV) は、非固定サンプルの変動係数 (37% 対 27%) よりわずかに高かっただけです。 同様に、未固定 LNCaP 細胞の EpCAM 発現の中央値は 1 細胞あたり 728,738 抗原でしたが、固定 LNCaP 細胞では 71% 減少して 1 細胞あたり 213,430 抗原となりました (p < 0.01)。 しかしながら、固定サンプルにおける EpCAM 発現の CV (51%) は、非固定サンプルの CV (54%) と同様でした。 すべての細胞株の Her2 発現の CV は 13 ～ 52% の範囲であり、EpCAM の場合は 30 ～ 75% でした。

非固定サンプルと比較して固定サンプルで観察された同様の変動を考慮すると、Her2 および EpCAM 発現の測定変動の主な原因は、実際の細胞株の変化ではなく、測定の変動に起因すると考えられます。 補足図S1では、同じデータポイントが時間内に示されており、複数の細胞株で同様の発現変化パターンも見られます。これは、変化が主に実験間の変動の結果であることと一致しています。 ただし、これらの細胞株間の発現の差が、我々が見つけた測定値のばらつきよりもはるかに大きいこともこのデータから明らかであり、正確な定量は得られないものの、この測定値を使用して抗原発現範囲を決定できることが示されています。

図 2 から、約 2 か月間隔で行われた異なる実験間では、測定された発現に比較的大きなばらつきが存在することが明らかです。 これが単一の実験での発現の比較にどの程度影響を与えるかを決定するために、同じ実験内で 3 つのサンプルを使用して PC3-9 および LNCaP 細胞上の EpCAM および Her2 の発現を測定することによって実験内の変動を決定しました。同じ週内で 3 回の反復を使用した実験間の変動の期間。 このために、培養条件の変動を避けるために固定細胞のバッチを使用しました。 結果は補足図S2に示されており、同じ日に行われた3回の実験では、LNCaP細胞で高発現したEpCAM抗原の実験内変動はCVが5.6％と比較的低いが、発現が低い抗原では増加することを示しています。 PC3-9 の Her2 発現では最大 144%。 同様に、実験間の変動は、LNCaP 細胞の EpCAM 抗原では 20% であり、PC3-9 細胞の Her2 抗原では 94% に増加します。 これは、抗原発現が低い細胞の抗原発現範囲、および中程度から高発現の細胞株における複数倍の変化を決定できることを裏付けています。 ただし、特に低い抗原発現の定量化は、細胞の正確な抗原発現レベルの特定の決定としてではなく、抗原発現範囲の確認として見なされるべきです。

多くの施設が同じ細胞株を使用しており、たとえば免疫磁気濃縮技術の直接比較が可能になっているようです。 しかし、施設では細胞株を長期間培養することが多く、培養条件の違いや単に継代時の確率的サンプリングにより、時間の経過とともにこれらの細胞の抗原発現が変化する可能性があります。 いくつかの腫瘍関連抗原の発現に存在する差異を測定するために、少なくとも 3 つの施設からの 4 つの細胞株と、American Type Culture Collection (ATCC) から直接購入したバイアルの発現レベルを比較しました。 このために、細胞株の一部を各施設で液体窒素中で凍結し、トゥウェンテ大学に発送しました。 補足表S1は、各施設の培養詳細と測定時の細胞の継代数を示しています。 ほとんどの場合、施設は独自の培養方法を使用していますが、ATCC の推奨から逸脱している可能性があります。 トゥエンテ大学では、細胞株の 1 つのすべての培養物を解凍し、約 1 週間増殖させました。 次に、1 回の実験で、その細胞株のすべての培養物の抗原発現が決定されました。 このようにして、各細胞株について、利用可能なすべての培養物の抗原発現が 1 回の実験で測定されました。

図 3 は、フローサイトメトリーを使用して測定された PE シグナルのヒストグラムを示しています。 補足図S3では、各抗原および細胞株の対応する抗原の平均数が示されています。 異なる施設で保管された培養物間のこれらの抗原の発現には、トゥウェンテ大学の LNCaP 細胞株における PSMA の発現低下や、すべての細胞株における CK 発現の大きな変動など、いくつかの違いが見られます。 SKBR3 の CK 発現および PC3 細胞株の EpCAM 発現では、これらの細胞株では、他のすべての細胞株が由来する ATCC での培養物にすでに 2 つの部分集団が含まれていることがわかります。 エラスムスとトゥエンテ大学は PC3 に同じ培養条件を使用しており、同様の継代数を持っていますが、EpCAM を高発現する亜集団はエラスムスで増殖しているようですが、低発現亜集団はトゥエンテ大学で優勢になっています。

ATCC、エラスムス MC (EMC)、ロンドン癌研究所 (ICR)、デュッセルドルフ大学 (UKD)、およびトゥエンテ大学の LNCaP、MCF7、PC3、および SKBR3 における EpCAM、Her2、PSMA、およびサイトケラチン (CK) の発現 ( UT）。 フローサイトメトリーを使用して測定された PE シグナルのヒストグラムが示されています。

EpCAM は CTC を捕捉するために主に使用される抗原であるため、この抗原の発現の変動は、CTC 濃縮技術の認識される捕捉効率の違いにつながることが予想されます。 これをテストするために、4 つの施設それぞれから正確な数の PC3 細胞を健康なドナーからの血液サンプルに加えました。 次に、CellSearch システムを使用してこれらのサンプルを処理し、各施設の PC3 細胞の回収率を決定しました。

図 4 には、測定された EpCAM 発現および 4 つの起点のそれぞれからの PC3 細胞の CellSearch 回収率が示されています。 回収率は、トゥエンテ大学で培養された PC3 細胞の 12% から、エラスムス MC で培養された PC3 細胞の 83% までの範囲です。 EpCAM 発現の対数変換後の線形回帰では、R2 が 0.97 の CSrec = − 101 + 30∙log (EpCAMexpr) の回帰が得られました。 細胞が実際に PC3 細胞であることを確認するために、PC3 (UT) および PC3 (EMC) に対してショート タンデム リピート (STR) 解析を実行し、これらの細胞株がすべて PC3 細胞 (ATCC) であることを確認しました。 この分析では、STR プロファイルで示されるように、使用した PC3-9 細胞が PC3 細胞株のサブクローンであることも確認されました。

ATCC、エラスムス MC (EMC)、ロンドン癌研究所 (ICR)、およびトゥエンテ大学 (UT) からの PC3 の EpCAM 発現と各細胞株の CellSearch 回収。 N = 3。エラーバーは平均値 ± SD を示します。

我々は、診断用白血球アフェレーシス (DLA) を受けている 13 人の転移性前立腺癌患者からの CTC の EpCAM 発現を評価しました。 CTCは、77.2〜97.1%（平均90.3%、SD 7.4%）の範囲の効率で白血球の免疫磁気除去によってDLA由来サンプルから濃縮されました。 入力サンプルとすべての患者の枯渇効率の概要を補足表 S2 に示します。 枯渇後、サンプルを CD45-、CD16-、ビオチン-FITC、Hoechst、Cytokeratin-APC、PSMA-PerCP/Cy5.5、および EpCAM-PE で染色しました。 洗浄後、サンプルを1 mL PBS/1%BSAに再懸濁し、有核イベントのみを含むHoechstの閾値を使用してFACS Aria II (BD Biosciences)で実行しました。 フローサイトメトリー測定の例を補足図S4に示します。 CD45/CD16/ビオチンが陰性で、Hoechst、サイトケラチン、PSMAが陽性の場合、イベントは CTC とみなされました。 CTC 識別基準に PSMA 陽性を追加すると、正しい識別の確実性が高まりますが、すべての CTC が PSMA 陽性であるわけではないため、このアプローチでは一部の CTC が見逃されます。 次に、同定された CTC について EpCAM 発現を定量化しました。 測定された強度が細胞株測定で測定された強度と直接比較できるかどうかを確認するために、DLA 材料に細胞をスパイクした後に PC3 および LNCaP 細胞の抗原発現を測定し、直接測定された同じ細胞の抗原発現と比較しました。 補足図S5に示された結果は、細胞あたりの抗原の測定数には差があるものの、この差は細胞株間および細胞株と患者CTC間に見られる差よりもはるかに小さいことを示しています。

図５Ａは、１３人の前立腺癌患者で見出された個々のＣＴＣの測定されたＥｐＣＡＭ発現レベルを示す。 患者あたり、中央値 15 CTC が測定されました (平均 148 CTC、範囲 2 ～ 1457 CTC)。 患者１２のＣＴＣ上のＥｐＣＡＭ発現は図５Ａのスケールを超えているため、図５Ｂでは対数スケールでも別に示されている。 測定された EpCAM 発現は、患者内および患者間の両方で大きなばらつきを示し、患者あたりの中央値は 35 ～ 89,534 (平均 24,993、SD 28,521) の範囲でした。 補足表S2には、すべての患者の測定されたEpCAM発現の平均、中央値およびCVが示されています。 ここでは、CellSearch システムを使用して見つかった PSMA 陽性 CTC の量と比較した CTC の相対的な回収率も示されています。

13 人の去勢感受性前立腺がん患者の白血球除去産物で見つかった CTC の EpCAM 発現。 (A) 線形スケールでの患者 P1 ～ P13 から回収された CTC の発現。患者間および患者内の両方で大きな変動を示します。 (B) 対数スケールで表した、患者 P12 から回収された CTC の発現。 ボックスは中央値±SDを示します。 自己蛍光に適用された補償により、一部の細胞では測定された発現が負に達しました。

患者の CTC の EpCAM 発現が、頻繁に使用されるがん細胞株の EpCAM 発現とどのように関連しているかを確認するために、すべての患者の CTC で測定された EpCAM 発現を組み合わせ、これを 6 ～ 20 日間測定した 5 つの異なるがん細胞株の EpCAM 発現と比較しました。図6に示すように、-月の期間。ここで、各円は別の患者で測定されたEpCAM発現を示し、円のサイズは測定されたCTCの数に関連しています。 示された p 値は、ノンパラメトリック コルモゴロフ – スミルノフ検定を使用して決定されました。 トゥエンテ大学で培養された PC3 および PC3-9 細胞株は患者の CTC と同様の発現を示す一方、他の 3 つの細胞株ははるかに高い EpCAM 発現を示し、評価における CTC 代用としては不適であることがわかります。 EpCAM ベースの濃縮または識別方法。

13 人の前立腺がん患者由来の CTC の EpCAM 発現と、トゥウェンテ大学で培養された 5 つの細胞株で測定された発現との比較。 円の位置は患者あたりの発現の中央値を示し、円のサイズは各患者から測定された CTC の数に関係します。 ボックスは中央値を水平線として 25 ～ 75 パーセンタイルを示し、ひげは 10 ～ 90 パーセンタイルを示します。 * は有意差を示し、ノンパラメトリック コルモゴロフ – スミルノフ検定を使用して決定された p 値を示します。

前立腺癌細胞株 PC3 および LNCaP、および乳癌細胞株 MCF7 および SKBR3 は ATCC (米国バージニア州マナッサ) から入手しました。 PC3 細胞株のサブクローンである PC3-9 細胞株 24 は、Immunicon (米国ペンシルバニア州ハンティンドンバレー) のご厚意により提供されました。 PC3、PC3-9、およびLNCaPは、すべて10% FBS (Sigma)および1% Pen/Strep (Lonza)を添加したDMEM (Lonza)中のRPMI1640 (Lonza)、MCF7およびSKBR3で培養しました。 細胞を湿潤雰囲気下で 37°で培養し、70 ～ 80% コンフルエンスに達したら 0.05% トリプシン - EDTA (Gibco、Life Technologies、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用してトリプシン処理しました。

この研究では、CTC 上の EpCAM 発現の測定のために 13 人の患者を参加させました。 これらの患者は全員、新たに診断され、サンプル収集時点ではまだ治療を受けていません。 これらの患者（年齢60～79歳、中央値70歳）は全員、転移性去勢感受性前立腺がん患者であり、7.5mLの血液サンプル中に2つ以上のCTCが存在することに基づいて進行中のPICTURES研究に含まれている。 スパイク実験の 1 つでは、SIBYLLA 研究の患者から採取した材料が使用されました。この研究には、補助内分泌療法を完了し、再発の臨床徴候がない乳がん患者が含まれています。

白血球除去療法は、Mout et al.29 によって記載された最適化された手順に従って、Terumo Spectra Optia を使用して実施されました。 サンプルは、エラスムス医療センターの医療倫理委員会によって承認された研究の一環として、ヘルシンキ宣言に従って収集されました (PICTURES 研究 [MEC20-0422] および SIBYLLA 研究 [MEC20-0384])。 健康な血液サンプルは、匿名化された健康なボランティアからトゥウェンテ大学の CellSave 採取管 (Menarini-Silicon Biosystems) に採取されました。 ヘルシンキ宣言に同意して、すべてのボランティアからインフォームド・コンセントが得られ、使用された採血手順は地元の医学研究倫理委員会 (METC Twente) によって承認されました。

発現は未固定の細胞、または記載されている場合は CellSave または 1% ホルムアルデヒドで固定された細胞で測定されました。 発現は、非結合抗体またはPE結合抗体のいずれかを使用して37℃で30分間抗原を標識することによって決定した。 結合していない抗体の場合、細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、二次抗マウスＰＥ抗体（１２－４０１０－８７、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３７℃で３０分間染色した。 EpCAMは、非結合型抗EpCAM抗体VU1D9（Immunicon、Huntingdon Valley、PA、USAからの寄贈）またはPE結合型VU1D9（SAB4700425-100TST、Sigma）を使用して測定しました。 Her2 発現は、非結合型 Her2 (米国ペンシルバニア州ハンティンドンバレーの Immunicon からの寄付) を使用して測定しました。 PSMA発現はPSMA-PE(342504、BioLegend)を使用して測定し、サイトケラチンはCK11-PE(5075S、Cell Signaling Technologies)を使用して測定した。 次いで、染色された細胞を遠心分離によって洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁し、その後、１０，０００個の細胞のＰＥシグナル強度をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。 細胞あたりの PE 分子の数は、PE 蛍光定量キット (340495、BD Biosciences) を使用して計算されました。 このキットの各チューブには、4 つの既知レベルの PE と結合したビーズの凍結乾燥ペレットが含まれています。 これら 4 つの母集団の幾何平均強度を使用して、供給者の指示に従って検量線を作成しました。 この検量線を使用して、幾何平均値を使用して測定された細胞上の PE 分子の数を決定しました。 二次染色のあるサンプルを含む実験では、非特異的染色を補正するために、二次抗体のみを使用して染色されたサンプルの幾何平均 PE 強度が測定強度から差し引かれました。 直接結合抗体を使用した測定では、未染色サンプルのシグナルがこの補正に使用されました。

異なる施設に存在する同じ細胞株の異なる培養物を比較するために、各細胞株のアリコートを液体窒素で凍結してトゥエンテ大学に送り、同時に各細胞株の新しいバイアルを ATCC に注文しました。 補足表S1には、各細胞株および施設の培養条件と継代数の概要が示されています。 到着後、すべての細胞を 10% FBS (Sigma) および 1% Pen/Strep (Lonza) を添加した RPMI1640 (LNCaP、PC3) または DMEM (MCF7、SKBR3) (Lonza) で約 2 週間培養し、その後トゥウェンテ大学で液体窒素中で再凍結させた。 各細胞株について、すべての培養物を同時に解凍し、同じ条件下で 1 ～ 2 週間培養し、その後、すべての抗原の発現を 1 回の実験で測定しました。

抗原発現の異なるレベルが免疫磁気捕捉に及ぼす影響を説明するために、さまざまな施設から入手した既知数の PC3 細胞を健康なドナーの血液 7.5 mL に添加しました。 このために、PC3 細胞を Hoechst で染色し、1 μL あたり約 50 細胞の濃度にしました。 3 ～ 5 個の 1 μl 液滴をスライドガラス上に置き、画像化しました。 これらの画像を使用して、実験後に各液滴内の細胞の数を手動で数えました。 4 mL の CellSearch 希釈バッファーを使用して、液滴をすすいで 7.5 mL の血液サンプルに入れ、その後、スライドガラスに残っている細胞を検査しました。 その後の濃縮と染色は、通常の CTC キットを備えた CellSearch システム (Menarini-Silicon Biosystems) を使用して実行されました。 CellTracks Analyzer II (Menarini-Silicon Biosystems) によるスキャンおよび分析後に見つかった PC3 細胞の数を使用して、回収率を計算しました。

癌患者由来の CTC 上の EpCAM 発現を評価するために、白血球の枯渇により 13 人の前立腺癌患者の DLA 材料から CTC を濃縮しました。 このために、エラスムス MC で取得した DLA サンプルのアリコートを CellSave 防腐剤で固定し、一晩かけてトゥエンテ大学に発送しました。 2 億個の白血球 (WBC) のアリコートも、CellSearch システムを使用してエラスムス MC で処理されました。 ここでは、PSMA が追加マーカーとして追加され、白血球除去後に見つかった DAPI + CK + PSMA + CD45-CTC の数と CellSearch システムを使用して見つかった数の比較が可能になりました。 トゥウェンテ大学で行われた除去では、平均 530 × 106 WBC (WBC 範囲 230 × 106 ～ 842 × 106 WBC) からなるサンプルアリコートを CD45-ビオチン (4 μg/mL、当施設で製造および結合) とインキュベートしました。 )、CD2-ビオチン (555325 BD Pharmingen)、CD16-ビオチン (555405 BD Pharmingen)、および CD19-ビオチン (555411 BD Pharmingen) を 15 分間処理します。 9 mL カゼイン緩衝液 (7 mM リン酸ナトリウム、41.5 mM 塩化ナトリウム、0.1% アジ化ナトリウム、50 mM EDTA、0.5% BSA、0.2% マウス血清、0.5% カゼイン、pH = 7.5) を添加した後、サンプルを次の方法で洗浄しました。 ８００Ｇで１０分間遠心分離し、６ｍｌのカゼイン緩衝液に再懸濁した。 これにストレプトアビジン磁性流体を添加し (18 μg/mL、BioMagnetic Solutions)、サンプルを室温で 15 分間インキュベートしました。 結合細胞の分離は、サンプルを四重極磁石に 10 分間置くことによって達成されました。 続いて、シリンジポンプ（Harvard Apparatus）に接続されたガラスパスツールピペットを使用して、結合していない画分を除去した。 パスツールピペットをチューブの中心に置き、２ｍＬ／分の速度で吸引を行った。 十分な枯渇レベルに達するために必要に応じて、磁気インキュベーションと吸引を数回繰り返しました。 CTC を同定するために、すべての細胞を染色するための Hoechst (H3570、Invitrogen)、CK11-APC (1A-108-C100、Exbio)、PSMA-PerCP/Cy5.5 (342512、 BioLegend)、および CTC および CD45-FITC (11-0459-42、eBioscience)、CD16-FITC (302,006、BioLegend)、およびストレプトアビジン-FITC (S3762- 0.1MG、Merck）を使用して、枯渇したサンプル内の残りの白血球を染色します。 ここでは、ストレプトアビジン-FITC を使用して、磁性粒子で標識されていない、枯渇手順中に細胞に結合した CD2-、CD16-、CD19-、または CD45-ビオチンを染色します。 すべての染色試薬を、細胞の透過性を高めるために、0.05% サポニンを含む緩衝液中で混合した。 正しい補正とゲーティングを可能にするために、いくつかのコントロールを使用しました (LNCaP と PC3-9 はそれぞれ CK11、PSMA、VU1D9、および Hoechst で染色しました。DLA はそれぞれ CD45/CD16/ストレプトアビジンと Hoechst で染色しました。DLA、LNCaP および PC3 の未染色サンプル) -9)。 次いで、染色された細胞を洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で蛍光強度を測定した。 CTC は、CD45/CD16/Strep-、CK/PSMA+ 細胞として同定されました。 EpCAM-PE シグナルは、PE 蛍光定量キット (340495、BD Biosciences) を使用して定量化されました。補足図 S4 も参照してください。 枯渇の手順として、不要な細胞の大きなバックグラウンドと染色ミックスのより複雑さが、測定された EpCAM 発現に影響を与えることが予想されるため、前立腺 (PICTURES 研究) または乳がん (SIBYLLA 研究) 患者からの DLA を約除去および染色手順を実行する前に 10,000 個の PC3 または LNCaP 細胞を調べ、スパイクされた細胞の測定された発現を、同じ実験で測定されたスパイクされていない細胞の発現と比較しました。

EpCAM 発現と CellSearch 回復の間の相関関係は、EpCAM 発現の対数変換後に決定されました。

正規分布を得るために、対数正規分布した抗原発現を対数変換し、一元配置分散分析を使用して比較しました。 Levene の検定では均一な分散が示されたため、Bonferroni の検定を実行してすべてのグループ間の統計的差異を決定しました。

単一ペア間の抗原発現を比較する場合、対数変換されたデータに対して 2 サンプルの t 検定が実行されました。

異なる細胞株、抗原、または調製方法からのペアのサンプルがグループ化された場合、ノンパラメトリックなウィルコクソン符号付き順位検定を使用して統計的差異が決定されました。

CTC の EpCAM 発現をさまざまな細胞株の EpCAM 発現と比較するために、対応のないサンプルに対するノンパラメトリック コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用しました。 すべての統計分析および相関分析は、Origin 2019b (OriginLab Corporation、ノーザンプトン、マサチューセッツ州、米国) を使用して実行され、有意性閾値 0.05 が使用されました。

この研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、PICTURES (MEC 20-0422) および SIBYLLA (MEC 20-0384) 研究の倫理委員会によって承認されました。

研究に関与したすべての被験者からインフォームドコンセントを得た。

抗原ベースの濃縮アッセイを効果的に開発、比較、テストするには、使用する CTC 代替物の抗原発現が実際の CTC を現実的に表す必要があります。 ここで最も重要な特徴は、標的抗原の発現です。 我々は、定量的フローサイトメトリーを使用して、前立腺がん患者由来のCTCにおける標的となることが多いEpCAM抗原の発現を、いくつかのよく知られた細胞株のEpCAM発現と比較しました。 ここで、定量的フローサイトメトリーを使用して測定された抗原の発現は多数の要因に依存することを認識することが重要ですが、そのうちの限られた数しか示していません。 これらの要因の 1 つは、細胞に結合した蛍光分子の数と実際の抗原の数との比率です。 この比率は、抗体の標識効率と、抗体 - 蛍光団複合体あたりの蛍光分子の数によって決まります。 前者は、使用する抗体クローン、抗体濃度、インキュベーション時間、インキュベーション温度などのいくつかの要因に依存しますが、完全な標識には決して到達しません 30。 後者は、直接抗体染色と二次抗体染色の違いで見ることができます (図 1A)。

未固定の細胞は細胞の特性を測定する最良の方法ですが、実際には患者のサンプルは翌日に処理されることがよくあります。 この点に関して、CellSave などの穏やかな固定液を使用することが抗原発現を保存する良い方法であることが示されていますが、より強力な固定 (ホルムアルデヒド) では抗原が検出抗体にアクセスしにくくなるように思われます。 さらに、固定が強くなると、0.05%サポニンによる透過処理が効果を失い、細胞内染色が妨げられます。

CTC で測定された EpCAM 発現は比較的低いため、これらの測定間の実験的変動も PC3-9 で観察されたものと同様であると予想されます (補足図 S2)。 ただし、CTC の変動を考慮すると、測定された発現範囲は関連しています。患者間で見られる EpCAM 発現は、患者 CTC と一部の試験細胞株の間で見られる EpCAM 発現の差よりも依然としてはるかに低いです。

さらに、より長い時間間隔で行われた独立した測定では、固定細胞の測定で観察された変動は、実験による変動も存在することを示しています。 ただし、患者の CTC は細胞株発現の測定と同じ期間中の 13 の異なる時点で測定されたため、両方の測定セットに対するこの実験変動の影響は同等であることが予想されます。

場合によっては、同様の継代数を持ち、同じ培地を使用して培養したにもかかわらず、異なる施設で培養された同じ細胞株の発現プロファイルにはいくつかの違いが見られます。 たとえば、エラスムス大学とトゥエンテ大学での PC3 細胞のさまざまなサブタイプの増殖は、同じ培地の使用だけが重要な要素ではないことを示しています。 おそらく、継代率、播種密度、培養フラスコの種類などの他の要因も影響します。

一部の CTC は、測定された EpCAM 発現がゼロ未満を示します。 これは、フローサイトメーターに存在するバックグラウンド信号に適用される補正によるものです。 ネガティブコントロールサンプルの幾何平均強度に基づいて各細胞に固定補正を適用すると、約半数の細胞ではこの補正が実際のバックグラウンドシグナルよりも大きくなり、場合によっては1個あたりのPE分子の計算量が減少することがあります。細胞がマイナスになる。 同様に、セルの約半分は、実際のバックグラウンド信号よりも低く補正されます。 変動を均等に分散させるために、これらの負の値をゼロに設定しないことにしました。

図6に見られるように、試験した細胞株のうち、PC3細胞およびPC3-9細胞のEpCAM発現は、前立腺がん患者由来のCTCの発現と最も類似している。 私たちの知る限り、CTC 上の EpCAM 発現を定量的に測定しようと試みた唯一の研究は、Rao らの研究です 24。 彼らの結果は、我々の調査結果と比較して、より高い測定された EpCAM 発現 (細胞あたり 49,708 抗原) を示しています。 ただし、これらの式は、Rao et al. のように直接比較することはできません。 彼らは、前立腺がん患者由来の CTC を使用するだけでなく、CTC の選択に最小の EpCAM 発現閾値も使用し、EpCAM 陰性 CTC を効果的に除外しました。 しかし、興味深いことに、彼らはまた、PC3-9細胞株のEpCAM発現がCTC代表として適切であると判断しました。これは部分的には、我々の培養物と比較してより高いEpCAM発現を有するPC3-9細胞の培養によるものです。

図 4 に示す線形回帰を使用して CTC の EpCAM 発現と CellSearch の回復を関連付けると、EpCAM 発現のみに基づくと、一部の患者の CTC の予想される回復は 1 ～ 5% の範囲であることが明らかになります。 以前の研究では、CellSearch システムの廃棄物中に追加の CTC が検出されました 13 が、ここまでの範囲ではありませんでした。 この理由は、CellSearch の回復が EpCAM 発現に依存するだけでなく、サイズなどの他の特性も CTC の免疫磁気捕捉において重要であるためであると予想されます。 したがって、比較的大きな PC3 細胞を捕捉するには、平均して小さな前立腺がん CTC よりも多くの EpCAM 発現を必要とする可能性があります。

この点に関して、我々の期待は、CellSearch 濃縮と比較した枯渇アプローチを使用した場合、EpCAM 発現と CTC の相対的回収との間の相関関係を見ることでもありました。 ただし、測定された 13 人の患者では、そのような関係は観察されませんでした (補足表 S2 のデータを参照)。 これは、部分的には、これらの患者における EpCAM 発現の正確なレベルの不確実性、および枯渇および染色手順中の CTC 損失の変動によるものと考えられます。 フローサイトメーターを使用する一部の患者でより多くの CTC が測定される可能性があるもう 1 つの要因は、フローサイトメーターの感度が高いため、等しい PSMA 発現を持つ細胞が CellSearch では PSMA 陰性としてスコア付けされる一方、より感度の高いフローサイトメーター測定では陽性とみなされます。

明らかにこれが唯一の重要な要素ではありませんが、最適化のために細胞株を選択するときは、実際の CTC で測定される発現範囲内の 1 つ以上の細胞株を使用することを目指す必要があります。 図 3 からわかるように、ATCC から購入した PC3 細胞の発現が実際の CTC で測定された値の最高であるため、これは、ATCC から購入した PC3 細胞が低発現 CTC 同等物として適していることを意味するものではありません。 この違いは、細胞株を使用して比較を行う場合には抗原発現を定期的に定量する必要があることも示しています。

この研究では、異なる施設で培養された細胞株は抗原発現に大きなばらつきを示すため、同じ細胞株を使用して異なる施設で抗原ベースの細胞濃縮方法を比較すると、捕捉効率に大きな違いが生じる可能性があることを示しました。 理想的には、本物の CTC と同等の発現を持つ細胞株が使用されます。 EpCAM については、去勢感受性前立腺がん患者間で異なる CTC の発現が示されましたが、CTC 濃縮技術の評価によく使用される多くの細胞株よりもはるかに低かったです。

現在の研究中に生成されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 この原稿で使用されているすべてのフローサイトメトリー データは、標準の .fcs ファイル形式で利用できます。 スパイクされた細胞のカウントに使用される画像と、回復の評価に使用される CellSearch スキャンは、オリジナルの .tiff 形式で入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

我々は、いくつかの乳がん細胞株と前立腺がん細胞株を提供してくださったエラスムス MC ロッテルダム、ロンドンがん研究所、デュッセルドルフ臨床大学に感謝します。 また、SIBYLLA 研究に由来するサンプルのアリコートを提供したエラスムス MC ロッテルダムにも感謝します。 GEDNAP Proficiency Tests Institute for Forensic Sc​​ience (ミュンスター) による STR 分析の実施に感謝します。

この研究は、NWO/KWF PICTURES プログラム (17915) によって部分的に支援されました。

Medical Cell Biophysics Group、Techmed Center、理工学部、Twente 大学、私書箱 217、7500 AE、エンスヘーデ、オランダ

アヌーク・メンティンク、レオン・WMM・テルスタッペン、ミシェル・スティーブンス

エラスムス大学医療センター、エラスムス MC 癌研究所、腫瘍内科、ロッテルダム、オランダ

クリスタニー・T・イセビア & ジャコ・クラーン

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概念化、LT; デザイン、AM、MS、LT。 分析、AM、MS。 取得、AM、KTI、JK、MS; 執筆、午前、MS。 レビューと編集、AM、KTI、JK、LT、MS。 視覚化、AM、MS。 監修、修士、修士

ミシェル・スティーブンスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Mentink、A.、Isebia、KT、Kraan、J. 他。 がん細胞株および循環腫瘍細胞の抗原発現の測定。 Sci Rep 13、6051 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-33179-y

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受信日: 2022 年 12 月 2 日

受理日: 2023 年 4 月 8 日

公開日: 2023 年 4 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33179-y

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